الكشف السريع عن النماء العصبي تعمل في خلايا الإنسان العصبية السلائف (الشخصيات)

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توصيف عمليات نمو الدماغ المبكرة للخلايا السلائف العصبية البشرية بطريقة سريعة وقابلة للتكرار ، وتحديد تأثيرات العوامل المهمة خارج الخلية في تنظيم هذه العمليات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة المهمة في مجالات الطب النفسي العصبي واضطرابات النمو العصبي مثل هل يعاني جميع الأفراد المصابين من نفس الشذوذ الخلوي ، أو بدلا من ذلك ، هل يظهر كل منهم خللا وظيفيا محددا لدى الشخص؟ الميزة الرئيسية لبروتوكولنا هي أنه سريع وقابل للتكرار بدرجة كبيرة وسهل التنفيذ.

على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لتقديم نظرة ثاقبة لاضطرابات النمو العصبي ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا لدراسة الاضطرابات التنكسية العصبية والعصبية والنفسية مثل مرض الزهايمر والاكتئاب. يعد العرض المرئي لبعض هذه الطرق ضروريا لأن بعض التقنيات تتضمن نقل الخلايا من طبق إلى آخر أو تتطلب تحليلات مورفولوجية يتم توصيلها بشكل أفضل من خلال العرض المرئي. لرفع الخلايا السلائف العصبية البشرية ، قم بشفط الوسط وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X.

قم بشفط المحلول الملحي المخزن بالفوسفات وأضف 500 ميكرولتر من محلول انفصال الخلية 1X إلى بئر مع الخلايا السليفة العصبية. ثم احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، استخدم ماصة P1000 لإضافة 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات يتم الاحتفاظ به في درجة حرارة الغرفة لغسل الخلايا وإزالتها.

بعد ذلك ، انقل الخلايا الموجودة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. اغسل البئر مرة أخرى بملليلتر واحد من محلول ملحي مخزن بالفوسفات وانقل الغسيل إلى الأنبوب. بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا عند 300 جم لمدة خمس دقائق لتشكيل الحبيبات.

بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في واحد إلى خمسة ملليلتر من وسط DMEM F12 الدافئ مسبقا. لوحة 100 ، 000 خلية في آبار ثلاثية في صفيحة 24 بئرا. بعد 46 ساعة ، أضف الثايميدين المضطرب إلى وسط المزرعة واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.

ثم ، بعد إزالة الوسط ، أضف 300 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين EDTA الدافئ مسبقا واحتضانه لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتفتيت الخلايا وإطلاق الحمض النووي. ثم قم بتشغيل حصادة الخلايا وتشغيلها. ضع ورق ترشيح في حصادة الخلايا.

استمر في جمع أنابيب حصادة الخلايا في صينية فارغة فارغة. ثم اضغط على الغسيل المسبق لتبليل ورق الترشيح. ضع أنابيب التجميع في آبار العينات وابدأ.

استخدم مصدر ضوء ساخن لتجفيف ورق الترشيح وترتيب القوارير المقابلة على الدرج. قم بإخراج الحشو الورقية في القوارير ثم أضف ملليلترين من كوكتيل التلألؤ السائل إلى كل قارورة. احتضان القوارير لمدة ساعة واحدة في عداد التلألؤ قبل تشغيل الجهاز للحصول على العدد في الدقيقة لكل عينة مما يعكس تخليق الحمض النووي النشط.

بذور 500 ، 000 خلية في طبق استزراع 35 ملم. ثم حرك الطبق في جميع الاتجاهات لتوزيع الخلايا بالتساوي. بعد ذلك ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 46 ساعة.

ثم أضف ميكرولترين لكل مليلتر من خمسة ملليمولار EdU إلى المزرعة واحتضنه لمدة ساعتين. بعد ذلك ، قم بفصل الخلايا وحبيبها. إلى بيليه الخلية ، أضف ثلاثة ملليلتر من 30٪ وسط التمدد مع أو بدون عوامل النمو أو الأدوية.

ضع ملليلترا واحدا من تعليق الخلية على الأطباق المطلية مسبقا واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. لدراسة عدد خلايا السلائف العصبية في المزرعة ، بعد يومين ، قم بتسمية وإعداد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. ثم قم بشفط الوسط من البئر وأضف 200 ميكرولتر من محلول انفصال الخلية 1X واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

بعد انفصال الخلية ، أضف 300 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X إلى كل بئر. استخدم ماصة P1000 لمحلول خلايا الماصة عدة مرات وافصل الخلايا عن اللوحة. بعد ذلك ، انقل محلول الخلية إلى أنبوب 1.5 مليلتر المحضر واقلب الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات.

باستخدام ماصة ، اسحب 50 ميكرولترا من الخلايا في منتصف الأنبوب وأضفها إلى محلول تريبان الأزرق في أنبوب سعة 0.5 ملليلتر. ثم عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. لتشكيل الغلاف العصبي، ضع ماصة ملليلتر واحد من وسائط التمدد بنسبة 100٪ في طبق مقاس 35 ملم دون أي ركيزة طلاء.

بعد ذلك ، أضف مليون خلية سلائف عصبية في كل من هذه الألواح واحتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 إلى 96 ساعة. لتحضير اللوحة لهجرة الغلاف العصبي ، قم بإذابة كميات الجل المقلدة ECM في ستة ملليلتر من وسط التمدد بنسبة 30٪. أضف ملليلترا واحدا من الجل المقلد ECM مع وسط تمدد بنسبة 30٪ في بئر واحد من صفيحة من ستة آبار.

ثم احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لصفيحة المجالات العصبية ، استخدم ماصة لجمع الخلايا الموجودة في الوسط من الطبق الذي يبلغ طوله 35 ملم ونقلها إلى أنبوب مخروطي الشكل. ثم قم بتدوير الأنبوب عند 100 جم لتكسير المجالات العصبية.

ثم, أعد تعليق الحبيبات في واحد إلى ثلاثة ملليلتر من وسط التمدد 30٪ الدافئ مسبقا. بعد ذلك ، قم بإدخال 200 ميكرولتر من المجالات العصبية المعلقة في الصفيحة المكونة من ستة آبار تحتوي على الجل المقلد ECM مع وسط تمدد بنسبة 30٪ وهز اللوحة. ثم احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

قم بشفط الجل المقلد ECM بوسط تمدد بنسبة 30٪ ثم قم بإصلاح الخلايا لمدة 30 دقيقة باستخدام 4٪ بارافورمالدهايد. لتحليل المجالات العصبية، التقط الصور باستخدام إعدادات تباين الطور بتكبير 10X. استخدم برنامج NIH ImageJ لقياس متوسط هجرة المجالات العصبية.

في ImageJ ، استخدم أداة الخط اليدوي لتتبع المحيط الخارجي للغلاف العصبي. بعد ذلك ، استخدم وظيفة القياس لحساب مساحة التتبع ، وتتبع كتلة الخلية الداخلية للكرة. اطرح كتلة الخلية الداخلية من إجمالي مساحة الغلاف العصبي لتحديد متوسط الهجرة.

تم إجراء التلوين الكيميائي المناعي لدراسة التعبير عن بروتينات الهيكل الخلوي وعوامل النسخ مثل SOX2 و PAX6 و nestin في الخلايا السليفة العصبية عند المرور الثالث. بعد ذلك ، تم التقاط صور تباين الطور لتحديد الخلايا الحاملة للعصب. من الصورة ، تعتبر الخلايا ذات العمليات التي تساوي أو أطول من جسمين من الخلية حاملة للخلايا العصبية ، في حين أن الخلايا ذات العمليات الأقصر من جسمي الخلية لا تعتبر حاملة للعصب.

لتأكيد تكوين الغلاف العصبي ، تم التقاط صور تباين الطور التي تظهر أن المجالات العصبية التي تم جمعها في النقطة الزمنية البالغة 72 ساعة يتراوح حجمها بين 80 ميكرومتر و 120 ميكرومتر ، وبالتالي يمكن استخدامها لمقايسة الهجرة. لتحديد القدرة التكاثرية ، نمت الخلايا السليفة العصبية في ظروف عامل نمو الخلايا الليفية أو التحكم وتلطخها لوجود EdU. تظهر الصور الفلورية على تباين الطور أن الخلايا المعالجة بعامل نمو الخلايا الليفية لديها نسبة أعلى من الخلايا المنخرطة في المرحلة S كما هو موضح في تلطيخ EdU.

بعد ذلك ، للتحقق من نمو العصبات ، تم فحص الخلايا في ظروف التحكم ومقارنتها ب PACAP. تم التقاط صور تباين الطور وتظهر زيادة في عدد الخلايا التي تحتوي على الخلايا العصبية تحت علاج PACAP. بعد ذلك ، لفهم هجرة الغلاف العصبي ، عولجت الخلايا بالببتيدات العصبية PACAP.

تظهر صور تباين الطور التي تم الحصول عليها زيادة في هجرة الغلاف العصبي مقارنة بعنصر التحكم. يحتوي بروتوكولنا على العديد من التقنيات والمقايسات ، ويتطلب كل منها فترات زمنية مختلفة. عند الإتقان ، يمكن أن يستغرق متوسط الاختبار من ساعتين إلى ثلاث ساعات للإعداد ومن 30 دقيقة إلى ثلاث ساعات للتحليل.

أثناء تنفيذ هذه الإجراءات ، من الأهمية بمكان التأكد من أنك تستخدم خلايا سلائف عصبية عالية الجودة ، وأن هذه الخلايا منفصلة تماما وموزعة بشكل موحد في جميع الظروف باستثناء مقايسة الغلاف العصبي. باتباع هذه الإجراءات ، يمكن إجراء تحليلات أخرى بما في ذلك النشاف الغربي ، و QRT-PCR ، والنسخ ، والبروتينات ، والتمثيل الغذائي من أجل توصيف الآليات الأساسية. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.