تطبيق القياس الكهربية لدراسة نشاط الناقلين محايدة الكهربائية

طريقة البقع العملاقة جنبا إلى جنب مع الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للأيونات هي طريقة متعددة الاستخدامات تستخدم لاكتشاف تدفقات الأيونات وتحديدها. على وجه التحديد ، يتم استخدامه لقياس تدفقات البروتونات الناتجة عن نشاط ناقل الأيونات المحايد الكهربائي ، أو مبادل الصوديوم والهيدروجين أو NHE ، والذي يتم التعبير عنه على غشاء الخلية. يولد مبادل الصوديوم والهيدروجين تدرجا للبروتونات على مقربة من غشاء البلازما ، ويشار إليه هنا على أنه حلقة برتقالية.

يتم قياس هذا التدرج للبروتونات عبر غشاء الخلية عن طريق تسجيل مشبك رقعة الخلية بالكامل جنبا إلى جنب مع تقنية تستخدم قطبا كهربائيا صغيرا انتقائيا للبروتون. يتم تحريك القطب الصغير الانتقائي للبروتون بالقرب من سطح الخلية ، حيث يسجل تدفق البروتونات التي تتحرك من الخلايا ، كما هو موضح هنا في الموضع A. وبعيدا عن سطح الخلية ، حيث يسجل تركيز البروتون الحر الموجود في المحلول المشار إليه بالموضع B. ثم ، العودة إلى الموضع A ، بالقرب من غشاء الخلية ، في حركة تذبذبية متكررة. يتم تسجيل فرق الجهد من A إلى B ويعتمد على ممثل نشاط NHE.

أيونات النقل مثل البروتونات عبر غشاء الخلية على العملية الضرورية للحياة. لذلك ، يتم تنظيم التغييرات في الأس الهيدروجيني بإحكام بواسطة مجموعة من الجزيئات ، بما في ذلك مبادل الصوديوم والبروتون ، وهو نظام استبعاد البروتون لغشاء البلازما. يعد القطب الكهربائي الدقيق ذو الأس الهيدروجيني المتذبذب جنبا إلى جنب مع لقط رقعة الخلية بأكملها نهجا جديدا لدراسة تدفق البروتون بوساطة نشاط مبادل الصوديوم والبروتون.

يتغلب تطبيق هذه الطرق على بعض القيود الرئيسية للتقنيات المستخدمة عادة لقياس نشاط مبادل الصوديوم والبروتون ، مثل الحساسية المعتدلة ، ودقة الوقت والتحكم الجيد الآخر في البيئة داخل الخلايا. سأقدم عرضا توضيحيا للأساليب مع معاوني ، الدكتور فيكتور بابيتش. سيكون الدكتور ماثيو هنري هو الراوي.

سنوضح تطبيق هذه الطريقة من خلال قياس نشاط الشكل الإسوي لمبادل الصوديوم والبروتون الثالث الذي يعد منظما رئيسيا لامتصاص الملح في الماء عبر الأمعاء وظهارة الكلى. يتم تصنيع الأقطاب الكهربائية الدقيقة الانتقائية للبروتون لقياس تركيز البروتون من أنابيب زجاجية قياسية بورسليكية. يتم سحب أقطاب زجاج البورسليكات التي يبلغ قطرها الخارجي 1.2 ملم وبدون خيوط باستخدام مجتذب عمودي ، باستخدام بروتوكول سحب مزدوج تقليدي.

يتم الحصول على طرف ماصة بقطر اثنين إلى ثلاثة ميكرومترات. توضع الماصات في حامل برطمان بحيث يكون طرف الماصة متجها لأعلى. بعد ذلك ، يتم تحضير خليط لسيليكون الماصات.

يسكب في جرة ويغلق الغطاء بإحكام. يتم تحضين الماصات بخليط السيليكون لمدة 24 إلى 48 ساعة. توخي الحذر ، تأكد من تحضير الخليط وسيليكون الماصات في درجة حرارة الغرفة في دخان كيميائي جيد التهوية.

املأ الماصة مرة أخرى بالراتنج الانتقائي للأيونات المناسب وضعها بعناية عموديا في حامل برطمان بحيث يكون طرف الماصة متجها لأسفل. للتحضير لتثبيت الرقعة، ابدأ بسحب ماصات تثبيت الرقعة من زجاج البورسليكات الرقيق بقطر خارجي يبلغ ملليمترين وقطر داخلي يبلغ 1.4 ملم في مجتذب رأسي باستخدام بروتوكول السحب المزدوج التقليدي. استخدم ماصة دقيقة مثبتة على مرحلة من المجهر المقلوب لعمل طرف ماصة عريض.

ضع الماصة بالقرب من السلك البلاتيني السميك للطرازة الدقيقة. قم بتشغيل الحرارة باستخدام مفتاح القدم الذي يتحكم في تشغيل وإيقاف التيار. قم بتسخين الزجاج ذو درجة الانصهار المنخفضة الذي يغطي منتصف السلك البلاتيني السميك للتشكيل الدقيق ثم حرك طرف الماصة بالقرب من الزجاج الناعم الذائب.

يحرك التسخين السلك البلاتيني قليلا نحو المركز. يعود السلك البلاتيني إلى الموضع الأولي وينكسر طرف الماصة. كرر الإجراء حتى يتم الحصول على قطر الطرف المطلوب وأخيرا ، استخدم الحرارة لتنعيم الحافة.

قطر أطراف الماصة 10 ميكرومتر بعد التلميع باستخدام microforge. يعد استخدام السلك البلاتيني السميك مفيدا من حيث وجود تمدد ضئيل بعد تشغيل الكهرباء واحتمال أقل لارتفاع درجة حرارة السلك والماصة بالتيار الزائد. بعد تفكيك الخلايا باستخدام التربسين وحظر التربسين ، يتم الاحتفاظ بالخلايا على شاكر مع هزاز لمنع تكوين التكتلات.

يتم ذلك لمدة تصل إلى ساعتين بعد التربسين. يتكون إعداد الفيزيولوجيا الكهربية من جهاز تحكم في درجة الحرارة لتنظيم درجة حرارة المحلول في نظام التروية. يتم إجراء جميع التجارب عند حوالي 37 درجة مئوية.

ومحول مرشح بصري للتحكم في عجلة المرشح للتصوير الفلوري. جهاز تحكم في صمام نظام التروية لتنظيم فتح وإغلاق صمامات نظام التروية. وجهاز التحكم في درجة الحرارة لتنظيم درجة حرارة غرفة التسجيل.

راسم الذبذبات لمراقبة الأشكال الموجية ومكبر للصوت مشبك التصحيح. جهاز كمبيوتر يقوم بتشغيل برنامج Capmeter هذا. ومقياس كهربائي لتسجيل إشارة القطب الكهربائي الصغير الانتقائي للأيونات.

ومكبر للصوت التفاضلي لتضخيم إشارة المقياس الكهربائي. تم تجهيز إعداد الفيزيولوجيا الكهربية أيضا بمجهر مقلوب مع وحدة تحكم في المرحلة ، واثنين من المتلاعبين الدقيقين مع وحدات التحكم الموضوعة في الموقعين الأيسر والأيمن من المجهر ، ونظام التروية مع سخان المحلول المضمن. بعد تركيب ماصة القطب الكهربائي الدقيق الانتقائية للأيونات على المعالج الدقيق، قم بتعبئة ماصة تثبيت الرقعة مرة أخرى بالمحلول داخل الخلايا.

تأكد من وصول المحلول إلى طرف الماصة. قد يتطلب الأمر عدة صنابير لطيفة للتخلص من الفقاعات الموجودة في طرف الماصة. ثم قم بتركيب ماصة تثبيت الرقعة على مرحلة الرأس من إعداد الفيزيولوجيا الكهربية.

انقل الخلايا السليمة برفق إلى غرفة التسجيل المملوءة بحجم محدد من محلول الاستحمام. من المهم الحفاظ على مرحلة الرأس بزاوية 45 درجة للمحور الأفقي. يضمن ذلك زاوية دخول الماصة المناسبة لتشكيل مانع تسرب شديد المقاومة.

أثناء خفض ماصة مشبك التصحيح في محلول الحمام، قم بتطبيق كمية صغيرة من الضغط الإيجابي على الماصة لتقليل فرصة انسداد الطرف. حدد خلية واقترب منها بكمية صغيرة من الضغط الإيجابي. توقف عن تحريك ماصة مشبك التصحيح بمجرد اقتراب الطرف من الخلية.

قم بخفض القطب الكهربائي الدقيق الانتقائي للأيونات في محلول الحمام حتى يصبح نفس المستوى البؤري لطرف ماصة مشبك التصحيح. عندما يتم وضع الماصة في منتصف الخلية ، ابدأ الختم عن طريق تطبيق كمية صغيرة من الضغط السلبي. يتم الحصول على ختم ميجا أوم في غضون ثوان قليلة.

تأكد من الحفاظ على إمكانات الاحتفاظ بواسطة مكبر الصوت عند صفر مللي فولت. أخيرا ، قم بتمزيق غشاء الخلية بسلسلة من نبضات الشفط القصيرة وابدأ التسجيل. باستخدام طريقة تسجيل الرقعة العملاقة ، من الممكن نفخ المحاليل بسرعة في الماصة الزجاجية عبر نظام نضح داخل الماصة لتعديل المحتوى داخل الخلايا للأيونات والدهون والبروتينات.

ضع ماصة الأقطاب الكهربية الدقيقة الانتقائية للأيونات بالقرب من الخلية التي تحتفظ بها ماصة المشبك الرقعة وابدأ في تذبذب ماصة القطب الكهربائي الدقيق الانتقائية للأيونات عن طريق تحريكها من الخلية وإليها. يسمح تطبيق هذه التقنية للمرء بدراسة التنظيم الجزيئي لمبادل الصوديوم والهيدروجين. بالاستفادة من طريقة البقع العملاقة ، تم تعديل التركيب داخل الخلايا ل ATP والدهون بواسطة نظام نضح داخل الماصة.

تسبب التروية داخل الخلايا من الأبيراز ، الذي يحلل ATP داخل الخلايا ويقلل من محتوى الفوسفوينوسيتيد في انخفاض بنسبة 50٪ في نشاط NHE الإسوي الثلاث. لم يتم عكس تأثير الأبيراز على نشاط NHE3 عن طريق التروية داخل الخلايا للفوسفوينوسيتيد ، PIP2. ومع ذلك ، فقد تم عكسه عن طريق التروية داخل الخلايا للفوفينوسيتيد ، PIP3.

يستفيد قياس نشاط NHE من الجمع بين طرق القطب الصغير الانتقائي للبروتون وطرق تثبيت التصحيح. يسمح هذا بدراسة الأساس الجزيئي وراء التنظيم التفاضلي ل NHE بواسطة الفوسفوينوسيتيدات وشلالات الإشارة النهائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس نشاط مبادل الصوديوم والبروتون باستخدام قطب كهربائي دقيق ذو درجة حموضة متذبذبة جنبا إلى جنب مع جميع لقطات رقعة الخلية.

ومثال على التطبيق المحتمل للأساليب.