لوسيفراس "التكامل بالتصوير الإنزيم" في أوراق نيكوتيانا بينثاميانا "تحديد عابر ديناميات التفاعل" البروتين-بروتين

ويصف هذه المخطوطة إجراء تجريبي السهل والسريع لتحديد تفاعلات البروتين البروتين استناداً إلى قياس النشاط لوسيفراس.

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف الكمي عن تفاعلات البروتين والبروتين في نظام التعبير العابر. يمكن أن يساعد هذا المقياس في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات معاملات إشارة الكونين مثل كيفية مراقبة اتجاهات بروتين البروتين لدينا كميا بعد المعالجة الكيميائية أو البيئية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم مقياس إضاءة أو كاميرا CCD للكشف عن النشاط اللذين ، والذي يمثل شدة اتجاه بروتين البروتين بحيث تكون النتائج أكثر دقة.

لبدء هذا الإجراء ، أضف مليلتر واحدا من محلول يحتوي على خمسة بالمائة هيبوكلوريت الصوديوم ونقطة صفر واحد بالمائة تريتون × مائة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة خمسة ملليلتر يحتوي على بذور. دع المحلول يرتاح لمدة خمس دقائق لتعقيم البذور. ثم اغسل البذور بالماء المعقم خمس مرات.

البذور المغسولة في مائتي ميكرولتر من الماء المعقم. باستخدام أطراف دقيقة ، ضع البذور الفردية بحذر على سطح وسط MS أجار المطلي. قم بتخزين الأطباق على درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة ثلاثة أيام لمزامنة الإنبات.

بعد ذلك ، احتفظ بألواح متوسطة في ظل ظروف النمو الطبيعية لمدة عشرة أيام. انقل الشتلات النابتة إلى التربة ، مع التأكد من عدم إتلاف الجذور. قم بتغطية الصينية بغطاء بلاستيكي شفاف طوال الليل للحفاظ على الرطوبة.

قم بزراعة النباتات في غرفة نمو خاضعة للرقابة لمدة سبعة أسابيع ، عندما تكون جاهزة لتسلل agrobacterium tumefaciens. للبدء ، قم بتوصيل مائة وخمسين نانوغراما من البلازميدات إلى سلالة الخلية المختصة ب a-tumefaciens GV3101. ضع الأنابيب التي تحتوي على ثقافة a-tumefaciens في شاكر ، واحتضنها لمدة أربع ساعات.

باستخدام قضيب زجاجي ، انقل الثقافة من الأنابيب إلى وسائط LB. استزراع أ-توميفاسينس ووسط أجار LB عند 28 درجة مئوية لمدة أربعة أيام. بعد ذلك ، استعد لتلقيح مستعمرة واحدة من كل لوحة في أنبوبها الخاص يحتوي على ثلاثة ملليلتر من وسط السائل LB.

رج العبوة عند 280 RBM عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لنشر المزرعة. بعد ذلك ، قم بنقل 75 ميكرولترا من الثقافة البكتيرية إلى 15 مل من وسط سائل LB الطازج الذي يحتوي على 15 ميكروغراما لكل مليلتر من الكاناميسين و 50 ميكروغراما لكل مليلتر من الريفامبيسين. استزراع البكتيريا عند 220 دورة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية لمدة 8 ساعات تقريبا حتى يصبح OD600 بين 0.5 إلى 1.

بعد ذلك ، انقل الثقافة إلى أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 4000 مرة من الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق البليت في 15 مل من محلول التحول.

جهاز طرد مركزي عند 4000 مرة من الجاذبية و 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم كرر خطوة التعليق والطرد المركزي مرة أخرى. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق البليت في 5 مل من محلول التحول.

دع البليت المعلق يرتاح لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في الظروف المظلمة. بعد ذلك ، إما إضافة محلول التحويل إلى OD600 هو 0.5 أو الجمع بين عينتين بحجم متساو لاختبار تفاعلات البروتين المقترنة. باستخدام إبرة مليلتر واحد من المحقنة ، تسلل الخلايا العالقة إلى الأوراق الرابعة إلى السابعة.

بعد ذلك ، قم بتغطية النباتات على الفور بغطاء بلاستيكي أسود لمدة 12 ساعة. أولا ، يجب أن تكون النباتات صحية جدا لضمان النجاح. ثانيا ، تأكد من عدم إتلاف أي أوراق أثناء عملية التسلل.

احتفظ بالدرج في الظلام لمدة 12 ساعة. ثم قم بزراعة النباتات في ظل الظروف العادية لمدة 2 إلى 4 أيام قبل اكتشاف نشاط لوسيفيراز. لبدء طريقة التصوير ، افصل ورقة متسللة.

ضع النشرة بأكملها على طبق من وسط MS أجار. باستخدام زجاجة رذاذ سعة 50 ملليلتر ، قم برش مخزن مؤقت يعمل لوسيفيرون على الجانب المحوري للأوراق. ثم احفظه في الظلام لمدة 5 دقائق لإخماد التألق الذاتي للكلوروفيل.

استخدم جهاز تخيل CCD مبرد بضوء منخفض تم تبريده إلى سالب 30 درجة مئوية لالتقاط الصور بوقت تعرض مملوء بالضوء يبلغ 50 مللي ثانية ، ووقت اكتشاف التلألؤ لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، قم بقطع شظايا الأوراق من منطقة التسلل لأوراق N-benthamiana. اغمر الشظايا في 100 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات في آبار الصفيحة البيضاء المكونة من 96 بئر.

أضف عشرة ميكرولترات من محلول عمل لوسيفيرون. دع الطبق يرتاح لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، قم بإجراء أي علاج محدد مرغوب فيه لدراسة ديناميكيات تفاعل البروتين ، وقياس اللمعان مباشرة باستخدام مقياس الإضاءة التجاري.

يظهر هنا عرض للنشاط اللذيذ لتمثيل تفاعلات COP 1 SPA 1. يتم تصوير النشاط اللذيذ ، الذي يتم اكتشافه عن طريق التلألؤ ، بواسطة كاميرا CCD. ينظر إلى تفاعلات COP 1 SPA 1 على أنها تؤدي إلى طفرة نحاسية في لوسيفيراز وظيفي.

ثم يتم تحديد نشاط لوسيفيراز تحت علاج الياسمين 8 بمرور الوقت. ينظر إلى تفاعلات COP 1 SPA 1 التي يمثلها نشاط لوسيفيراز تنخفض تدريجيا في الظلام. يقلل العلاج بالياسمين 8 من هذه التفاعلات.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في 1 أسبوع ، بعد أن تصبح النباتات جاهزة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على نباتات صحية. تسلل إلى الأوراق بعناية وقم بتضمين عناصر التحكم بشكل صحيح.

بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال معاملات الإشارات لاستكشاف ديناميكيات تفاعل البروتين بطريقة سريعة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة نباتات التبغ ، وتسلل البكتيريا الزراعية إلى أوراق التبغ ، واكتشاف الأنشطة اللذيذة.