توليف وتحليل الطيف الكتلي اليغو-بيبتويدس

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية تصنيع الببتويدات قليلة الببتيد يدويا وكيفية تحليل تسلسل المونومر باستخدام تقنيات قياس الطيف الكتلي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة المبتدئين في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الببتويد مثل كيفية صنع الببتويدات وكيفية توصيف تسلسل المونومر الخاص بها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تصنيع الببتويدات ذات بقايا المونومر الخاصة وتحليلها في مختبر الكيمياء التحليلية القياسي.

على الرغم من أن هذه الطريقة تركز على الببتويدات قليلة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل الببتيدات والنيوكليوتيدات قليلة النواة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية لأن تحقيق ظروف قياس الطيف الكتلي المثلى أمر صعب بدون عرض بصري. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أردنا توصيف السمات الهيكلية للببتويدات بطرق قياس الطيف الكتلي الترادفي.

قم أولا بوزن 84 ملليغرام من راتنج أميد Rink وأضفه إلى وعاء تفاعل الطور الصلب من مادة البولي بروبيلين سعة 10 ملليلتر. ثم أدخل المكبس في الوعاء. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من TMF إلى وعاء التفاعل وقم بتغطية الوعاء بغطاء ضغط.

حرك الوعاء على شاكر في درجة حرارة الغرفة بزاوية حركة حوالي 12 درجة و 385 تذبذبا في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. بعد إزالة الغطاء ، قم بتصريف المحلول في حاوية النفايات عن طريق دفع مكبس وعاء التفاعل. أضف ملليلترين من 20٪ بيبيريدين في DMF إلى الوعاء وقم بتغطية الوعاء.

بعد تحريك الوعاء لمدة دقيقتين ، قم بتصريف المحلول في حاوية النفايات. كرر الإجراء ، أضف ملليلترين من محلول 20٪ Pep DMF إلى الوعاء وقم بتغطية الوعاء. حرك على الخلاط لمدة 12 دقيقة وصفي المحلول في حاوية النفايات.

بعد غسل الراتنج ، قم بإجراء تفاعل أستلة البرومو ، عن طريق خلط مليلتر واحد من 0.8 مولار من حمض البروموسيتيك في DMF ومليلتر واحد من 0.8 مولار DIC في DMF في دورق الخطر في دورق الخطر انقل الخليط إلى وعاء التفاعل الذي يحتوي على الراتنج وقم بتغطية الوعاء. حرك الوعاء على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

بعد التحريض ، قم بتصريف المحلول في حاوية النفايات. بعد غسل الراتنج ، قم بإجراء تفاعل إزاحة مع إضافة مليلتر واحد من 2 ميثوكسي إيثيل أمين في DMF إلى الوعاء. بعد تغطية الوعاء ، حركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.

ثم صفي المحلول في حاوية النفايات. بمجرد اكتمال دورات إضافة المونومر ، امزج 92 ميكرولترا من أنهيدريد الخليك ، و 43.5 ميكرولتر من DIPEA ، ومليلترين من DMF في دورق لصنع كوكتيل الأستلة. أضف كوكتيل الأستلة إلى الوعاء الذي يحتوي على الراتنج.

بعد تغطية الوعاء ، حركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة. عند الانتهاء ، قم بتصريف المحلول في حاوية النفايات. بعد غسل الراتنج باستخدام DCM ، امزج 3.8 مل من TFA و 100 ميكرولتر من ثلاثي الأيزوبروبيلسيلان و 100 ميكرولتر من الماء من درجة HPLC في دورق لعمل كوكتيل الانقسام.

أضف كوكتيل الانقسام على الفور إلى الوعاء الذي يحتوي على الراتنج. بعد تحريك الوعاء في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، قم بإزالة الغطاء وجمع محلول الترشيح في أنبوب طرد مركزي من مادة البولي بروبيلين سعة 50 مل. أضف ملليلتر واحد من TFA إلى الوعاء وقم بتغطيته.

بعد التحريك لمدة دقيقة واحدة ، اجمع محلول الترشيح في نفس أنبوب الطرد المركزي. بعد ذلك ، قم بتبخير TFA بتيار لطيف من غاز النيتروجين حتى يبقى حوالي ملليلتر واحد من المحلول اللزج. أضف 15 مل من ثنائي إيثيل الأثير إلى المحلول اللزج وقم بتغطية أنبوب الطرد المركزي.

احتضان الخليط في فريزر 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعتين على الأقل للحصول على راسب صلب أبيض. بعد الحضانة ، مع الحفاظ على برودة أنبوب الطرد المركزي ، قم بعمل مادة صلبة باستخدام جهاز طرد مركزي عند 4427 مرات G لمدة 10 دقائق. عند الانتهاء ، قم بإزالة غطاء الأنبوب وصب ثنائي إيثيل الأثير بعناية في دورق

بعد غسل المادة الصلبة بثنائي إيثيل الأثير ، جففها بتيار لطيف من غاز النيتروجين. بعد ذلك ، أضف 10 مل من الماء من درجة HPLC لإذابة المادة الصلبة المجففة. قم بتمرير المحلول من خلال مرشح حقنة نايلون بحجم منفذ 0.45 ميكرون واجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي من مادة البولي بروبيلين 50 ملليلتر وزنه مسبقا.

الرف بتجميد المحلول الببتويد عن طريق تدوير أنبوب الطرد المركزي في كوب بوليسترين موسع مزدوج مكدس سعة 12 أونصة ، يحتوي على النيتروجين السائل. ثم قم بتجميد المحلول المجمد طوال الليل لإنتاج الببتويد الصلب. بعد تحضير محلول العينة الببتويد لتحليل MS ، قم بإزالة أي جزيئات محتملة غير قابلة للذوبان في المحلول المخفف ، عن طريق إجراء الطرد المركزي عند 4427 مرة G لمدة ثلاث دقائق.

انقل حوالي 700 ميكرولتر من الجزء العلوي من المحلول إلى أنبوب طرد مركزي آخر سعة 1.5 ملليلتر لصنع محلول عمل MS الببتويد بتركيز حوالي 10 إلى سالب خمسة ضرس. بمجرد تعيين معلمات أداة MS ، أضف ما يقرب من 300 ميكرولتر من محلول عمل MS الببتويد في حقنة مليلتر واحد. وقم بتوصيل المحقنة بمدخل ESI باستخدام أنابيب polyetheretherketone الشعرية.

ثم ضع المحقنة أسفل مضخة الحقنة واضبط معدل التدفق على 10 ميكرولتر في الدقيقة لضخ محلول العينة في مدخل ESI. قم بتشغيل جهد إبرة ESI لتنشيط عملية ESI ثم قم بتشغيل الكاشف. اضبط الشاشة في وضع الملف الشخصي ونطاق نسبة الشحن الرئيسية أو M / Z من 100 إلى 1500.

عرض الطيف الكتلي لملف التعريف الموضح في نافذة ملف التعريف. في نافذة الطريقة ، استخدم دقيقتين كوقت تشغيل. ثم افتح نافذة التسجيل ، واملأ اسم ملف propr وابدأ في تسجيل الطيف.

تحسين شدة ذروة الببتويد المبروتين عند M / Z 1265. اضبط نطاق M / Z من 1150 إلى 1350 واضبط الجهد الشعري أثناء عرض شدة الذروة بالمللي فولت الموضحة في نافذة الملف الشخصي. الآن قم بتبديل الأداة إلى وضع MSMS في نافذة الطريقة ، واستخدم 1265 ككتلة Q1 الأولى واترك الكتلة الأخيرة Q1 فارغة.

استخدم 100 ككتلة Q3 الأولى و 1400 ككتلة Q3 الأخيرة. ثم قم بتشغيل غاز CID. بعد ذلك ، اضبط طاقة الاصطدام على 45 فولت.

وضغط غاز الاصطدام عند 1.5 ملليتور. اعرض الطيف الكتلي الجانبي المعروض في نافذة الملف الشخصي مع ملاحظة ذروة أيون الببتيد عند M / Z 1265 والقمم ذات القيم M / Z المنخفضة التي تمثل أيونات الشظايا من أيون الببتيد السلائف. الآن اضبط طاقة الاصطدام وضغط غاز الاصطدام لتحسين عرض طيف التجزئة.

في نافذة الطريقة، استخدم دقيقتين كوقت تشغيل. ثم افتح نافذة التسجيل ، واملأ اسم الملف المناسب وابدأ في تسجيل الطيف. يظهر هنا هيكل الببتويد غير الضار المركب مع الأستلة الطرفية n.

يتم عرض مخطط التجزئة المتوقع للببتويد هنا ، حيث يشير البروتون الموجود في الدائرة المتقطعة إلى البروتون المتحرك الذي من شأنه أن يؤدي إلى تجزئة الببتويد أثناء تجربة CIP. إذا حدث تجزئة في جميع روابط الأميد المتاحة ، فسيتشكل ما مجموعه ثمانية شظايا طرفية n وثمانية شظايا طرفية C. على سبيل المثال ، يتم عرض الهياكل وقيم الشحنة الرئيسية المقابلة لأيون B4 و Y5 أيون.

يتم سرد قيم الشحنة الرئيسية المحسوبة لجميع أيونات الأجزاء من V1 إلى V8 ومن Y1 إلى Y8 هنا. يظهر الطيف الكتلي الكامل للأيون الببتويد الملقب ذروة عند M / Z 1265 المقابلة للأنواع المبروتين وذروة عند M / Z 1287 المقابلة لتكيف أيون الصوديوم للببتويد. تتوافق القمتان في M / Z 633 و 644 مع الببتويدات المبروتين المبروتين المزدوج والمختلطة على التوالي.

يظهر طيف MSMS الببتوي المبروت ذروة عند M / Z 1265 تتوافق مع الأنواع المبروتة وتصل إلى ذروتها عند كتلة أقل لشحن القيم المقابلة لأيونات الشظايا من أيون الببتويد. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تقنية التوليف في يوم إلى يومين ويمكن إجراء تقنية قياس الطيف الكتلي في غضون ساعة إلى ساعتين ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة إجراء قياس الطيف الكتلي ، من المهم التحقق من أداء الجهاز.

إذا لزم الأمر ، يمكن للمرء إجراء ضبط تلقائي للآلة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل نمذجة الحليب من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل التأكيدات المحتملة التي يمكن أن يتكيف معها الببتويد. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف تقنية قياس الطيف الكتلي المتقدمة والتوصيف الهيكلي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع الببتويدات يدويا وكيفية تحليل تسلسل المونومر باستخدام تقنيات قياس الطيف الكتلي. لا تنس أن العمل مع المواد الكيميائية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما استخدام معدات الحماية الشخصية أثناء القيام بهذا الإجراء.