حمل جزئ لوكس Cre في قشرة الدماغ الماوس عن طريق انهانسر في الرحم

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد فسيفساء وراثية في القشرة الدماغية للفأر عن طريق تحفيز إعادة تركيب Cre-Lox من خلال التثقيب الكهربائي في الرحم. يمكن أن تساعد طريقة توليد الفسيفساء الجينية هذه في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأعصاب. مثل تحديد ما إذا كان الجين ضروريا لنمط ظاهري عصبي معين بطريقة مستقلة للخلية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن نظام إعادة التركيب الفعال Cre-Lox يتم دمجه مع تقنية توصيل الجينات الفعالة بنفس القدر في التثقيب الكهربائي للرحم. على الرغم من أن هذه الطريقة تركز على استهداف الخلايا العصبية القشرية من الطبقة إلى ثلاث ، إلا أنه يمكن استخدامها لاستهداف الخلايا العصبية في أعماق الطبقات القشرية الأخرى. عندما حاولنا صنع فسيفساء وراثية في أنسجة دماغنا ، واجهنا العديد من المشكلات في جعل حيواناتنا التجريبية على قيد الحياة بعد الولادة ، لذلك أدخلنا العديد من التبسيطات والتحسينات على تقنيتنا.

قم بإعداد ماصة ذات طرف مستدق طويل جدا وطرف رفيع جدا، وهو نموذجي للماصات لحقن الخلايا الجذعية الجنينية أو النقل النووي عن طريق إدخال الشعيرات الدموية الزجاجية أولا في مجتذب الماصة. بعد تثبيت المشابك ، قم بتنشيط البرنامج لسحب بروتوكول ، مما يؤدي إلى إنشاء تفتق على الشعيرات الدموية الزجاجية. تأكد من أن طول الاستدقاق يتراوح بين 10 و 15 مم باستخدام مجهر ضوئي مركب.

بعد ذلك ، لكسر طرف مركز الماصة ، امسح مهمة واحدة على دورق سعة 50 مل وقم بتمديده بيد واحدة. من ناحية أخرى ، ادفع الماصة المسحوبة ، بحيث يكون الجانب المستدق لأسفل ، بشكل عمودي عبر مركز المنديل مما يتسبب في حدوث كسر نظيف في الاستدقاق. تحقق من حجم الفتحة تحت مجهر ضوئي مركب.

ثم قم بمعايرة الماصة عن طريق شفط 1 مللي لتر من 0.4٪ Trypan blue و PBS إلى ماصة مملوءة جزئيا وقم بإخراج الماصة بعلامات 1 مللي لتر بناء على ارتفاع 1 مللي لتر في الماصة. استخدم الماصة المعايرة لإخراج الماصات المسحوبة الأخرى قبل التخلص منها. ضع الماصات في حامل الماصة الخالية من الغبار والجزيئات الأخرى.

بعد تخدير الفأر الحامل بعمق في E-15.5 ، اختبر منعكس التصحيح عن طريق إمالة غرفة الحث برفق وملاحظة استجابة الماوس. إذا كان المنعكس الصحيح غائبا ، فقم بنقل الفأر إلى منطقة التحضير الجراحي وإعطاء الأيزوفلوران المستنشق من خلال مخروط الأنف للحفاظ على مستوى التخدير الجراحي. استخدم الملقط لاختبار منعكس الدواسة للتحقق من التخدير.

راقب معدل التنفس بجهد ، وابحث عن التنفس العميق والمنتظم وأن الأغشية المخاطية وردية اللون ورطبة. ضع ما يكفي من مرهم العيون البيطري على العينين لتغطيتهما بالكامل للحماية من الجفاف. دلكي كريم إزالة الشعر على منطقة البطن بمسحات قطنية حتى يذوب فرو البطن.

ثم امسح فرو البطن. نظف بعناية أي بقايا متبقية وكريم مزيل الشعر باستخدام 70٪ من الإيثانول ومسحات القطن. ضع محلول فرك اليود على منطقة البطن بحركة دائرية.

ثم استخدم ستارة جراحية لعزل منطقة الجراحة والحفاظ على الظروف المعقمة. بعد إجراء شق بطني بطول 2 سم في الجلد ، ابحث عن الخط الوسط لتصور خط الوسط للبطن المستقيم. اسحب العضلة لأعلى وبعيدا عن البطن وقم بعمل شق خط الوسط بطول 2 سم لكشف تجويف البطن باستخدام تقنيات التعقيم.

باستخدام طرف ماصة دقيقة معقمة سعة 10 مللي لتر ، قم بتوزيع الكاربروفين في تجويف البطن لعلاج التسكين. بعد ذلك ، قم بتثبيت ملقط بعوض هارتمان على الحافة اليسرى لشق البطن المستقيم. ضع الملقط على طبق بتري المقلوب على يسار الشق ، مع إبقاء الجانب الأيسر من الشق مفتوحا.

بعد تثبيت الجانب الأيمن من الشق بطريقة مماثلة ، ضع إسفنجة الشاش حول منطقة الشق. باستخدام ملقط حلقي بدون برغي محدد متصل ، اسحب الرحم بين أي جنينين متجاورين دون سحق أو إصابة أي نسيج. ابدأ في سحب جميع الأجنة من خلال الشق ، ووضعها فوق إسفنجة الشاش.

قم بتوصيل ماصة معايرة بمجموعة أنبوب الشفاط وحقن 1 مللي لتر بالضبط من محلول الحمض النووي المحضر من خلال جدار الرحم في البطين الجانبي لكل جنين. استخدم الإبهام والسبابة للتلاعب بالأجنة ، مما يسمح بدفع الأجنة برفق على جدار الرحم أثناء الحقن. يظهر البطينان الجانبيان على شكل بقعة أغمق على الدماغ الظهري للجنين.

تأكد من الحقن الناجح من خلال ملاحظة التربان الأزرق يملأ البطين الجانبي. بعد حقن جميع الأجنة ، ضع كاثود الأقطاب الكهربائية من نوع الملقط على الرحم ، مباشرة فوق القشرة الإنسية والذيلية لاستهداف القشرة البصرية. ضع الأنود في الأسفل والأمامي لرأس الجنين.

باستخدام دواسة القدم ، قم بتشغيل نبضات 550 مللي ثانية من 50 فولت مفصولة بفاصل زمني يبلغ 950 مللي ثانية. بعد التثقيب الكهربائي لجميع الأجنة ، أعد الرحم إلى تجويف البطن في نفس الاتجاه الذي تم العثور عليه. استخدم المحلول الملحي لتليين الرحم أثناء توجيهه يدويا وبرفق شديد ، مع الحرص على عدم إزاحة الأجنة من موضعها في الرحم.

أغلق عضلات البطن بخيوط قابلة للامتصاص. استخدم غرزة بسيطة متقطعة ، وربط الأطراف بعقدة الجراح. أغلق طبقة الجلد بخيوط قابلة للامتصاص.

ضع كمية صغيرة من لاصق الأنسجة لإغلاق الجرح. ضع لاصق المناديل على العقد لمنع فكها. استخدم ماصة دقيقة لإزالة أي مادة لاصقة للأنسجة تحيط بالجرح يمكن استنساخها.

بمجرد أن تجف المادة اللاصقة للأنسجة ، قم بإزالة من الأيزوفلوران واسمح للأنثى بالتعافي بمفردها في قفص دافئ. استمر في مراقبة الماوس حتى يتعافى تماما ويتصرف بشكل طبيعي. بمجرد إزالته ، ضع الأنثى مرة أخرى في قفص مع الذكر.

ضع الجمجمة على سطح مستو باستخدام مناديل مبللة بطبقة واحدة مبللة ب 1-x PBS. باستخدام الملقط ، قم أولا بإزالة العظم القذالي. ثم قم بإزالة العظام الجدارية بعناية ، وإزالة الملقط بعيدا عن سطح الدماغ.

قم بإزالة أي سحايا بعناية لمنع تلف القشرة. قم بتثبيت الجزء الخلفي من الملقط أسفل الدماغ على طول الجمجمة لقطع أي أعصاب قحفية وإزالة الدماغ. استخدم شفرة حلاقة أحادية الحافة لعمل قطع إكليلي بحوالي 0.5 مم منقاري إلى بريجما ، وقطع إكليلي آخر حوالي 0.5 مم ذيلية للأنسجة ذات الأهمية.

كتلة الأنسجة جاهزة الآن للتقسيم. يؤدي حقن 1 مللي لتر من 2 مجم / مل من GFP Cre إلى توزيع متناثر للخلايا المصنفة ، والتي يمكن أن يكون بعضها مشرقا. نظرا لأن الأنسجة مقطوعة عند 100 ميكرون ، يتم الحفاظ على معظم العرش الشجيرية.

عندما يتم إجراء التثقيب الكهربائي في الرحم في اليوم الجنيني 15.5 ، يحدث وضع العلامات عبر الطبقات القشرية الثانية والثالثة. يمكن ملاحظة العمود الفقري المتغصني عند التكبير العالي. ينتج عن حقن 1.5 مللي لتر من 2 مجم / مل من GFP Cre وضع علامات كثيفة للغاية ، والتي يمكن أن تكون دون المستوى الأمثل حيث يصعب تتبع مصدر الأعصاب والعمود الفقري المتغصن.

ومع ذلك ، من خلال اختيار خلية ساطعة في محيط المنطقة المسماة ، لا يزال من الممكن تصوير خلية عصبية وعملياتها. بدلا من ذلك ، يؤدي حقن تركيبات SuperNova إلى توزيع متناثر للطبقة الثانية إلى ثلاث خلايا عصبية تم تصنيفها بشكل مشرق للغاية. بمجرد إتقان جراحة التثقيب الكهربائي في الرحم ، ستستغرق أقل من 30 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء مع تركيبات الحمض النووي الأخرى ، من المهم أن تتذكر تجربة تركيزات وأحجام مختلفة ، فهذا سيساعد في تحقيق التناثر المطلوب في الملصقات المطلوبة لتحليل الفسيفساء. استخدمت نتائجنا التمثيلية إما بنية واحدة أو بنية SuperNova تم اختراعها مؤخرا. في الأخير ، وجدنا أنه يمكننا تحقيق وضع علامات متناثرة ممتازة ، مع زيادة سطوع الخلايا العصبية.

يمكن تكييف هذه التقنية لإنشاء أنسجة دماغية فسيفسائية بطرق أخرى. على سبيل المثال ، يمكن دمج تحرير الجينات CRISPR و Cas9 مع التثقيب الكهربائي في الرحم ، أو يمكن دمج إعادة تركيب Cre-Lox مع الحقن داخل البطين للنواقل الفيروسية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد للعديد من التقنيات المبسطة والمكررة المستخدمة لتحقيق فسيفساء وراثية متناثرة ، بحيث يمكنك الجمع بين إعادة تركيب Cre-Lox والتثقيب الكهربائي في الرحم معا.

نتمنى لكم كل التوفيق.