مقايسة الفلورة يستند إلى الخلية بسيطة للكشف عن الأجسام ضد مستقبلات ن-الميثيل-د-اسبارتاتي (نمدا) في الدم

الهدف العام من هذا الاختبار هو الكشف عن الأجسام المضادة الذاتية ضد مستقبل NMDA في دم المرضى الذين يشتبه في إصابتهم بالتهاب الدماغ المناعي الذاتي. يساعد هذا المقياس في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في التشخيص التفريقي للمرضى الذين يعانون من أعراض عصبية نفسية حادة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها إجراء فحص بسيط وموثوق.

ابدأ هذا الإجراء بإعداد ألواح استزراع مغلفة بالجيلاتين. Aliquot 200 ميكرولتر من محلول الجيلاتين 2٪ لكل بئر من صفيحة استزراع 48 بئرا واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد 30 دقيقة ، استنشق محلول الجيلاتين من الآبار.

البذور في كل بئر 5 مرات 10 إلى خلايا HEK293 الرابعة في 200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا ، تحتوي على 10٪ FBS. احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مزودة ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، يستبدل وسط الاستزراع المستهلك في كل بئر ب 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع الطازج، الذي يحتوي على 10٪ FBS.

التوسع وفقا لإجمالي عدد الآبار في التجربة ، قم بإعداد المحلول A عن طريق خلط البلازميد NR1-GFP مع وسط الاستزراع. تحضير المحلول B عن طريق خلط كاشف التعدي مع وسط الاستزراع. تحضير المحلول C عن طريق خلط المحلول A والمحلول B واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بنقل 40 ميكرولتر من المحلول C لكل بئر يحتوي على خلايا HEK293. قم بتدوير اللوحة برفق واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مزودة ب 5٪ من ثاني أكسيد الكربون طوال الليل. تحقق من التعبير عن البروتين المؤتلف NR1-GFP في الخلايا المضيفة تحت مجهر فلوري بتكبير من 40 مرة إلى 200 مرة ، قبل الشروع في مقايسة التألق المناعي القائم على الخلية.

لبدء هذا الفحص ، قم أولا بشفط الوسط المستهلك من آبار لوحة الثقافة ثم اغسل كل بئر ب 200 ميكرولتر من PBS ثلاث مرات. أضف 200 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ إلى كل بئر واحتضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. قم بشفط محلول بارافورمالدهيد من الآبار واغسل كل بئر ب 200 ميكرولتر من PBS ثلاث مرات.

بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من الحليب الخالي من الدسم بنسبة 10٪ في محلول PBST إلى كل بئر واحتضن الطبق في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف لمدة ساعة واحدة. استنشق الحليب الخالي من الدسم بنسبة 10٪ في محلول PBST من الآبار واغسل الآبار ب 200 ميكرولتر من PBST مرة واحدة. احتضان الآبار بالبلازما المخففة من واحد إلى 100 في PBST كجسم مضاد أساسي مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

بعد ساعة واحدة ، قم بشفط البلازما المخففة من الآبار واغسل كل بئر ب 200 ميكرولتر من PBST ثلاث مرات. أضف إلى كل بئر 200 ميكرولتر من IgG المضاد للإنسان للماعز ، مقترنا مع Alexa Fluor 594 واحتضان لوحة الثقافة في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بشفط الماعز IgG المضاد للإنسان المقترن بمحلول Alexa Fluor 594 واغسل كل بئر ب 200 ميكرولتر من PBST ثلاث مرات.

بعد غسل PBST الثالث ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الجلسرين ، الذي يحتوي على DAPI ، إلى كل بئر. راقب الخلايا وصورها تحت المجهر الفلوري باستخدام المرشح الصحيح لكل صبغة وقطعة عين 10 مرات مع أهداف أربع مرات و 10 مرات و 20 مرة. تظهر هذه الصور التمثيلية التي تم التقاطها بعد 24 إلى 30 ساعة من التعدي خلايا HEK293 التي تعبر عن NR1-GFP.

ما يقرب من 30٪ من الخلايا لديها إشارة خضراء تحت المجهر الفلوري. في صور Alexa Fluor 594 المقابلة ، تشير الإشارة الحمراء في اللوحة B إلى ارتباط الأجسام المضادة الذاتية لمستقبلات NMDA ب NR1 المعبر عنها في خلايا HEK293. تشير الإشارة الحمراء الضعيفة في اللوحة E إلى ضوضاء الخلفية لصور Alexa Fluor 594.

تم استخدام الخلايا التي تعبر عن NR1-GFP لفحص وجود الأجسام المضادة الذاتية لمستقبلات NMDA في عينة البلازما البشرية. في هذه الصور المدمجة ، يشير اللون الأصفر إلى تحديد موقع NR1-GFP والأجسام المضادة الذاتية لمستقبلات NMDA. تشير الأسهم إلى أمثلة على الخلايا ذات التحديد المشترك البارز.

سيتم تفسير عينة البلازما التي تظهر تداخلا أكبر من 30٪ من الإشارات الخضراء والحمراء على أنها إيجابية في هذه الحالة. في الصورة المدمجة للتحكم السلبي ، هناك تداخل ضئيل بين الإشارات الخضراء والحمراء ، مما يؤكد الارتباط المحدد للأجسام المضادة الذاتية لمستقبلات NMDA ب NR1-GFP في المقايس. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذه التقنية ، من المهم أن تتذكر أنها مجرد إجراء فحص. باتباع هذه الإجراءات ، يمكن إجراء تدابير أخرى مثل تحليل اللطخة الغربية والتحليل القائم على الأنسجة للإجابة على أسئلة إضافية مثل خصوصية الحالات الإيجابية. بعد التطوير ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الطب النفسي لاستكشاف التشخيص التفريقي للمرضى الذين يعانون من حالات الطوارئ العقلية الحادة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الفحص للكشف عن الأجسام المضادة الذاتية ضد مستقبلات NMDA في الدم.