بناء منصة فرز الفائق لتقييم عدم تجانس التضخيم الجين HER2 في سرطان الثدي

الهدف العام من هذا الإجراء المختبري هو تحديد وقياس ومقارنة عدم التجانس الجيني داخل الورم HER2 في سلسلة كبيرة من سرطانات الثدي المعالجة بشكل غير متجانس عن طريق التهجين الموضعي عالي الإنتاجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الترجمة والبحث في اختيار سرطان الثدي مثل دراسة عدم تجانس تضخيم جين HER2 ، وهي مجموعة كبيرة من الحالات التي تم استردادها من أرشيفات علم الأمراض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتحليل انفصام HER2 عالي الإنتاجية عبر مناطق طبوغرافية مختلفة من سرطانات الثدي المتعددة وغير المتجانسة.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في التهجين في الموقع لأن الدراسات بأثر رجعي تتطلب عادة تحليل العينات الأرشيفية التي خضعت لإجراءات تثبيت ومعالجة وتخزين مختلفة. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قررنا إعادة تصنيف جميع سرطانات الثدي من قاعدة البيانات المؤسسية الخاصة بنا منذ عام 2003. ستظهر جوليا إركولي ، فنية من مختبرنا على هذا الإجراء.

ابدأ هذا البروتوكول باختيار المرضى وعينات الأنسجة كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بإنشاء ملف جدول بيانات جديد وفتحه، يتضمن سجلات المناطق المميزة لكل حالة. قم بتضمين أعمدة منفصلة لمعرف الحالة ومعرف الكتلة ومعرف المنطقة ونوع الأنسجة والتضاريس والتشكل وحالة المؤشر الحيوي وجميع الميزات الكيميائية المناعية الأخرى المتاحة.

إنشاء مشروع TMA. حدد كتل مستلمي PMA بالانتقال إلى ملف ، جديد ، كتلة. انقر فوق الحقل الأول لملء وكتابة أبعاد كتلة البارافين.

بعد ذلك ، قم بإنشاء مشروع مصفوفة الأنسجة من خلال الانتقال إلى ملف ، جديد ، مصفوفة الأنسجة. انقر على أيقونة الاستيراد، ثم اختر ملف القالب الخاص بكتلة المستلم التي تم إنشاؤها مسبقا. انقر فوق التالي.

ثم اختر ملليمترا واحدا كحجم البقعة بالنقر فوق الزر الدائري. اختر 500 ميكرون كتباعد موضعي ، وهو المسافة بين مركزين من البقع المجاورة. ثم انقر فوق رمز الآلة الحاسبة لحساب العدد الإجمالي للنقاط التي تم إنشاؤها ، والتي يجب أن تكون 231.

ثم انقر فوق الزر تحديد لإنشاء شبكات وشبكات فرعية. يحذف العمودان الثامن و15 والخط المركزي. حافظ على ثلاث نقاط من السطر الأول للتوجيه.

يجب أن تشمل الخريطة النهائية عددا إجماليا قدره 183 نقطة. حدد قائمة أنواع الأنسجة من خلال الانتقال إلى قائمة أنواع الأنسجة الجديدة والملف. ثم حدد المشروع بالانتقال إلى ملف ، مشروع جديد ، معزز.

بعد ذلك قم بإعداد كتل القبول. املأ القوالب المعدنية المطهرة بالبارافين المرن عند 65 درجة مئوية. اترك كتل البارافين لتبرد في درجة حرارة الفيلم طوال الليل داخل القوالب المعدنية.

في اليوم التالي ، استخرج كتل البارافين من القوالب المعدنية. قم بإنشاء TMA باستخدام مصفوفة مؤتمتة أو شبه مؤتمتة عن طريق تشغيل المصفوفة أولا ثم إدخال كتل القبول على منصة العرض الدوارية. حدد موضع البداية على كل كتلة مستلم باستخدام مفاتيح الأسهم لتحريك ضوء الليزر ومحاذاته مع الحافة اليسرى العلوية على البارافين لكتلة المستلم.

انقر فوق التالي وكرر المحاذاة الرأسية. انقر فوق التالي مرة أخرى لإنشاء ثقب تلقائيا في الإحداثيات المحددة مسبقا لكتلة المستلم. أفرغ الثقب.

ضع كتلة المتبرع لأخذ العينات وقم بإزالة قلب الأنسجة من منطقة الاهتمام المشروحة مسبقا. أدخل قلب الأنسجة المانحة في الفتحة الموجودة في الكتلة المتلقية. ثم قم بإزالة كتلة المتبرع من المصفوفة.

كرر هذه الخطوات حتى يكتمل التحليل الحراري التقني. ضع جانب الأنسجة من كتلة TMA التي تم إنشاؤها حديثا على شريحة فارغة معقمة وضعها في فرن المختبر على حرارة 45 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. اضغط برفق على الكتلة الموجودة على الشريحة لمدة خمس ثوان لتسطيح نوى الأنسجة.

كرر مرة واحدة لمدة مرتين. بعد ذلك ، قم بتغطية سطح أنسجة TMA بطبقة رقيقة من البارافين المرن عند 65 درجة مئوية. اترك كتلة TMA في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

أخيرا ، انقل كتلة TMA عند أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة قبل إجراء التحليلات الكيميائية النسيجية والكيميائية المناعية كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع شرائح TMA لتحليلها عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم ابدأ أداة وبرنامج أداة الصبغة المناعية.

في طريقة العرض الرئيسية ، انقر فوق زر البروتوكولات ثم انقر فوق إنشاء / تحرير البروتوكولات. حدد إجراء كوكتيل ISH المزدوج لتعديل القالب الأساسي. ضع علامة على الخبز في قائمة الصناديق واضبط درجة الحرارة على 63 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

ثم وضع علامة على deparaffinization. بعد ذلك ، ضع علامة على تكييف الخلية في قائمة الصناديق. ثم ضع علامة على تكييف الخلية CC2 واضبط درجة الحرارة على 86 درجة مئوية ووقت الحضانة على أربع دقائق.

ضع علامة على CC2 الخفيف لمدة ثماني دقائق ، قياسيا لمدة 12 دقيقة وممتد لمدة ثماني دقائق. ضع علامة على ISH-Protease ثلاثة في قائمة الصناديق واضبط وقت الحضانة على 16 دقيقة. حدد HER2 ثنائي نيتروفينيل وكروموسوم 17 ديجوكسيجينين.

احتضن لمدة 16 دقيقة ثم اضبط التمسخ لمدة 20 دقيقة على 80 درجة مئوية. اضبط وقت حضانة المسبار على ست ساعات. ثم اضبط وقت حضانة SISH المتعددة على 32 دقيقة.

اضبط الكرومات الفضية ووقت الحضانة على أربع دقائق. بعد ذلك ، اضبط وقت حضانة المضاعف الأحمر على 24 دقيقة. اضبط الكرومات الحمراء ووقت الحضانة على ثماني دقائق.

ثم ضع علامة على Counterstaining في قائمة الصناديق ، وحدد hematoxylin two واضبط وقت الحضانة على ثماني دقائق. ضع علامة على التلوين المضاد في قائمة الصناديق ، وحدد كاشف الأزرق واضبط وقت الحضانة على أربع دقائق. أخيرا ، قم بإجراء التحليل الفصامي ل HER2.

قم بتقييم تضخيم جين HER2 على أنه إيجابي إذا كانت نسبة مسبار تعداد كروموسوم HER2 17 أكبر من أو تساوي 2.0 مع متوسط عدد نسخ HER2 أكبر من أو يساوي 4.0 إشارات لكل خلية. قم بالتقييم على أنه سلبي إذا كانت نسبة مسبار تعداد كروموسوم HER2 17 أقل من 2.0 مع متوسط رقم نسخ HER2 أقل من 4.0 إشارات لكل خلية. تظهر هنا صور مجهرية تمثيلية توضح تحليل التهجين الفضي في الموقع لسرطان الثدي غير المتجانس HER2.

في هذا المثال النموذجي ، تظهر منطقتان متميزتان من سرطان الثدي الغازي عالي الدرجة من نوع خاص نتائج مختلفة من حيث تضخيم جين HER2 ، والتي يتم تصورها على شكل نقاط سوداء ، مقارنة بمسبار التعداد المركزي 17 ، الذي تم تصوره على شكل نقاط حمراء. على وجه الخصوص ، تم تضخيم منطقة واحدة تنتمي إلى قلب الورم وتظهر نمط تلطيخ السيتوكيراتين السابع غير المنتظم HER2 ، بينما أظهرت بقعة واحدة أمام الجبهة الغازية نمط HER2 من النوع البري. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تحليل انفصامي مقروء لمصفوفات الأنسجة التي تتضمن سرطانات الثدي المتعددة وغير المتجانسة.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في يومي عمل من اختيار الحالة. على الرغم من أن هذه الطريقة محسنة لسرطان الثدي ، إلا أنه يمكن ترجمتها إلى أنواع أخرى من السرطان يكون فيها عدم تجانس HER2 وثيق الصلة مثل سرطان المعدة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو التقييم البسيط ل HER2 لأنها مصممة لرسم خرائط شاملة للمناطق الطبوغرافية المتعددة في سلسلة أكبر من سرطانات الثدي.

أثناء حضور هذا الإجراء ، من المهم تجنب أي صدع في كتلة TMA. حتى الحد الأدنى من الكراك في البارافين يستنتج الجودة وقابلية التكرار والوضوح العام للتهجين في الموقع. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تصوير قياس الطيف الكتلي MALDI من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول بروتينات سرطان الثدي ، لا سيما من حيث عدم التجانس داخل الأورام وفيما بينها.

لا تنس أن العمل مع لكمات TMA وشمع البارافين الساخن يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء قفازات النتريل التي تستخدم لمرة واحدة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.