سوبريتينال زرع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية إلى نموذج كبير العينين من ضمور الجغرافية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نموذج حيواني ذو عيون كبيرة للضمور الجغرافي لزرع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية الجنينية المشتقة من الجنين البشري في العين وتقييم تكامل الخلايا المانحة باستخدام التصوير المقطعي للتماسك البصري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الطب التجديدي ، مثل العلاج القائم على الخلايا الجذعية للأمراض التنكسية. الميزة الرئيسية لهذا الإعداد الجراحي هي المصدر غير المحدود للخلايا السليمة والإعداد الجراحي للحقن تحت الشبكية ، والذي له الكثير من التشابه مع الإجراء المخصص للمريض.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج التنكس البقعي المرتبط بالعمر من خلال التباهي بالخلايا الظهارية الصبغية للشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. تقوم فني لدينا ، مونيكا أرونسون ، بتثبيت الأرنب في موضعه حتى نتمكن من تصور وتصوير شبكية العين باستخدام التصوير المقطعي البصري المتناسق. بعد تخدير الأرنب وفقا لبروتوكول النص ، ضع الأرنب تحت المجهر الجراحي بحيث يكون الرأس مواجها للجراح.

بعد ذلك ، استخدم ضام الجفن لإزالة الجفون وقطعة قماش معقمة لإزالة غشاء النيكتيتان. بالنسبة للجراحة المجهرية ، استخدم تقنية بارس بلانا عبر الزجاجية ذات منفذين أو اختيارية ثلاثية المنافذ قياس 25 مع مبازل غير صمامية لإدخال أدوات الجراحة المجهرية. تحتوي آلة استئصال الزجاجية متعددة الوظائف على منافذ لتوصيل قنية التسريب ، والإضاءة الداخلية ، والجسم الزجاجي ، والليزر الداخلي.

بالنسبة للحقن تحت الشبكية ، فإن الإضاءة الداخلية فقط إلزامية مما يجعل الإعداد ثنائي المنافذ كافيا. باستخدام ملقط الجلطة للاستيلاء على الملتحمة وإزاحتها ، قم بتغطية موقع الإدخال. أدخل أحد المبازل العلوية عبر الصلبة ، من واحد إلى ملليمترين من ليمبوس ، بزاوية متوازية من ثلاثين إلى خمس وأربعين درجة.

تابع إدخال المبزل في منتصف الحافة. ثم أدر المبزل تسعين درجة وقدمه إلى العين ، مستهدفا القطب الخلفي. سيمنع ذلك تسرب ما بعد الجراحة من هذا التصلب ويقلل أيضا من خطر الإصابة بالتهاب باطن المقلة.

كرر مع المبزل العلوي الثاني. عند إدخال المبزل ، من المهم أن تكون من واحد إلى ملليمترين من الحافة لحفر نفق الإدخال واستهداف القطب الخلفي لتقليل مخاطر الإصابة بالعدوى والنزيف الزجاجي وانفصال الشبكية ولمس العدسة. ضع الدموع الاصطناعية كجل مقبض على القرنية ثم ضع عدسات لاصقة مسطحة تستخدم مرة واحدة على القرنية لتصور شبكية العين.

بعد ذلك ، قم بإسقاط خمسمائة ميكرولتر من يودات الصوديوم في حقنة سعة ملليلتر واحد متصلة بأنبوب تمديد يديره مساعد وقنة متعددة الرؤوس عيار 38 يديرها الجراح. أدخل مسبار الإضاءة الداخلية من خلال المبزل العلوي الأيسر. بعد ذلك ، أدخل قنية الحقن من خلال المبزل العلوي الأيمن وقم بدفع القناة عبر المساحة الزجاجية باتجاه شبكية العين ، مستهدفا المنطقة الواقعة أسفل رأس العصب البصري مباشرة.

اسمح لطرف القناة بلمس شبكية العين ببطء حتى يظهر التبييض البؤري. لا تدع القناة تخترق شبكية العين لأن ذلك قد يسبب النزيف. الآن ، عند اختراق شبكية العين بالإبرة ، قم بحقن خمسين ميكرولترا من يودات الصوديوم تحت الشبكية على مدى خمس ثوان.

نظرا لوجود مستوى انقسام طبيعي بين شبكية العين والمشيمية الأساسية ، يجب أن تتشكل فقاعة شبه شفافة مرئية بوضوح تدريجيا أثناء الحقن. أثناء الحقن ، اسحب الإبرة ببطء ولكن تأكد من الحفاظ على الطرف داخل الفقاعة لتقليل الارتجاع. بعد إزالة الإضاءة الداخلية وقنية الحقن ، استخدم ملقط الجلطة لإزالة المبازل.

ثم استخدم الطرف ، أو الطرف الحاد للملقط ، لتطبيق ضغط خفيف لمدة ثلاثين ثانية على بضع التصلب الناعم بدون خياطة. أثناء الشفاء ، اعتني بالحيوان وفقا لبروتوكول النص وانتظر سبعة أيام للزرع. بعد سبعة أيام من حقن يودات الصوديوم وبعد إعطاء تريامسينولون داخل الجسم الزجاجي ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بإزالة وسط تمايز الخلية من طبقة أحادية hESC-RPE متقاربة بأربعة وعشرين بئر واستخدم خمسمائة ميكرولتر من PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم لغسل كل بئر.

بعد تربسين الخلايا ، قم بإمالة اللوحة وإزالة التربسين بعناية للسماح للخلايا بالبقاء ملتصقة باللوحة. اجمع الخلايا في ثمانمائة ميكرولتر من وسط التمايز الطازج الذي تم تسخينه مسبقا بدرجة حرارة سبع وثلاثين درجة مئوية عن طريق سحب العينة برفق ، أو حتى الكشط إذا لزم الأمر ، للحصول على معلق خلية واحدة. باستخدام صفر نقطة اثنين بالمائة من التريبان الأزرق ، احسب الخلايا في غرفة مقياس الدم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

ثم أضف خمسة ملليلتر من وسط التمايز إلى تعليق الخلية وقم بالطرد المركزي للخلايا عند ثلاثمائة مرة جم ، في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في PBS المعقم حديثا بتركيز نهائي قدره ألف خلية لكل ميكرولتر. قم بتقسيم تعليق الخلية السابق إلى ستمائة ميكرولتر واحتفظ بها على الجليد حتى وأثناء الجراحة.

بعد تخدير الأرنب وتوسيع حدقة العين وفقا لبروتوكول النص ، ضع الأرنب مع مواجهة الرأس للجراح. استخدم ضام الجفن لإزالة الجفون وقطعة قماش معقمة لإزالة غشاء النيكتيتان. بالنسبة للجراحة المجهرية ، استخدم تقنية بارس بلانا عبر الزجاجية ذات منفذين أو اختيارية ثلاثية المنافذ قياس 25 مع المبازل الموضوعة في نفس المواضع كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو.

إذا كانت عمليات استئصال التصلب السابقة مرئية ، فقم بإجراء إدخال المبزل بجوار مواقع الإدخال هذه ، ولكن ليس من خلالها ، لتقليل مخاطر التسرب بعد الجراحة. ضع الدموع الاصطناعية على العين كما كان من قبل وضع عدسات لاصقة مسطحة تستخدم مرة واحدة فوق المحلول على القرنية لتصور شبكية العين. بعد وضع الطرف بشكل صحيح واستهداف مركز المنطقة المعالجة مسبقا من يودات الصوديوم ، والتي تتميز بانعكاس الإضاءة الداخلية المعدنية المميزة ، قم بحقن خمسين ميكرولترا من تعليق hESC-RPE المختلط برفق.

يجب أن تنفصل شبكية العين الحسية العصبية بسهولة ، مما يؤدي إلى تكوين فقاعة مرئية بوضوح. أثناء الحقن ، اسحب الإبرة ببطء ولكن تأكد من الحفاظ على الطرف داخل الفقاعة لتقليل الارتجاع. بعد إزالة الإضاءة الداخلية وحقن القنية ، استخدم ملقط الجلطة لإزالة المبازل واستخدم الطرف الحاد من الملقط لتطبيق ضغط خفيف لمدة ثلاثين ثانية كما كان من قبل.

استخدم التصوير المقطعي البصري للتماسك البصري للمجال الطيفي ، أو جهاز SD-OCT ، مع البرنامج المصاحب للحصول على فحوصات B مقطعية للحيوانات المعالجة ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ضع المخدر والموسع بحدقة العين في حامل قابل للتعديل للحصول على مسار خال من العوائق من مصدر ضوء الجهاز إلى شبكية الأرانب. لتجنب تشويش الصورة ، حافظ على رطوبة القرنية عن طريق شطفها بالمحلول الملحي الموضعي كل ثلاثين إلى ستين ثانية.

احصل على ما لا يقل عن ثلاثة فحوصات OCT باستخدام تنظير العين بالليزر الماسح الضوئي متحد البؤر بالأشعة تحت الحمراء المتزامن أو الصور المرجعية لانعكاس SLO متحد البؤر التي تمثل الجزء العلوي والمركزي والسفلي من المنطقة المحقونة. احصل على ألوان ليزر متعددة متزامنة لصور قاع العين مع انعكاس ليزر SLO متحد البؤر باللون الأزرق والأخضر والأشعة تحت الحمراء ومتعدد الألوان. التقط صورا ذاتية التألق بالضوء الأزرق باستخدام قدرة الليزر بالضوء الأزرق لجهاز SD-OCT.

عرض الصور التمثيلية في الجسم الحي ل BAF و IR-cSLO و SD-OCT لشبكية أرنب ألبينو طبيعية هنا. يوضح تفجير صورة SD-OCT طبقات الشبكية المختلفة بمستوياتها المميزة من انعكاس الضوء التي تم التقاطها بواسطة أداة SD-OCT. كما هو موضح في صورة SD-OCT هذه ، التي تم التقاطها بعد ثلاثة أشهر من حقن خمسين ميكرولترا من محلول يودات الصوديوم المليمولاري ، يتم إنشاء فقاعة تحل شبكية العين الخارجية وتدهورها تدريجيا.

يمكن ملاحظة ترقق الطبقات العصبية الشبكية الخارجية في SD-OCT ومناطق hypo-BAF ، بما يتوافق مع فقدان RPE ، وبالتالي إعادة إنشاء نمط ظاهري يشبه GA. عند تحديد منطقة الضرر ، أعيد حقن خمسين ألف خلية hESC-RPE للزرع ، مما أدى إلى إنشاء فقاعة ثانية تم حلها. توجد مناطق معتدلة إلى معتدلة فرط BAF مع زيادة فرط BAF على حدود منطقة الضرر ، مما يدل على الإجهاد المزمن ل RPE الأصلي.

الفقاعة المقابلة لحقن hESC-RPE في عيون غير معالجة مسبقا تظهر بقع من الخلايا المصطبغة في صورة MC وهياكل الشبكية المحفوظة جيدا في فحص SD-OCT للمقارنة. إن إتقان هذه الطريقة السريرية الجميلة للحقن تحت الشبكية سيسهل الزرع السريري للعلاج الخلوي لحالات ، مثل التنكس البقعي المرتبط بالعمر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد الحقن تحت الشبكية في نموذج نوع الحياة ، وكيفية تحضير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية للحقن تحت الشبكية ، وكيفية تصور تكامل الخلايا المانحة باستخدام التصوير المقطعي للتماسك البصري.