كريسبر/Cas9 باستخدام الجينات للتحقيق في نشاط النمطان Calreticulin المسخ في الخلايا المكونة للدم سيتوكين تعتمد على تحرير

الهدف العام من هذه التجربة هو استخدام تحرير الجينات CRISPR / Cas9 لنمذجة طفرات الكالريتيكولين في الخلايا المكونة للدم المعتمدة على السيتوكين من أجل دراسة نشاطها المسرطن. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأورام الخبيثة الدموية مثل الوظيفة البيولوجية لطفرات الدافعة عند التعبير عنها على المستويات الفسيولوجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم نظام تحرير الجينات CRISPR / Cas9 لنمذجة ودراسة الوظيفة البيولوجية للجينات المشاركة في السرطان.

لتلدين oligos وفسفرها ، أضف الكواشف إلى ما مجموعه 10 ميكرولتر في أنبوب PCR محفوظ على الجليد. اضبط البرنامج في الدراجة الحرارية. استخدم الماء لتخفيف التفاعل بعد اكتمال الدورة.

لهضم ناقل lentiGuide-Puro ، قم بإعداد 50 ميكرولتر من تفاعل الهضم. ثم ابدأ تفاعل الهضم عند 55 درجة مئوية عند كتلة حرارية. بعد ساعة واحدة ، أضف ميكرولتر إضافيا من إنزيم التقييد BsmB1 واستمر في التفاعل لمدة ساعة أخرى.

لإزالة الفوسفورة من العظم المقطوع ، أضف سبعة ميكرولترات من محلول تفاعل الفوسفاتيز ولترين ميكرولترين من إنزيم الفوسفاتيز إلى ناقل الجهاز الهضمي. ثم احتضن الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بتنقية عظم الظهر المقطوع بالفعل وإزالة الفوسبات باستخدام مجموعة تجارية.

لتحضير خليط الربط ، أضف 15 نانوغراما من عظم الظهر المهضوم والكواشف الأخرى إلى أنبوب PCR محفوظ على الجليد واضبط الحجم على 10 ميكرولتر بالماء. احتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم قم بتحويل الخلايا المتوافقة مع STBL3 بميكرولترين من خليط الربط.

ثم طبق على طبق أجار مرق lysogeny يحتوي على 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الأمبيسلين. بعد ذلك ، احتضن اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية. اختر ثلاث مستعمرات وقم بتلقيحها.

قم بإجراء إعداد مصغر لكل ثقافة وتسلسل موقع إدخال oligo باستخدام برايمر منطقة محفز U6. خلايا بذور hek293t على طبق 10 سم. واتركه للحضانة بين عشية وضحاها.

لتحضير خليط الحمض النووي للتعداء ، قم بتعبئة 45 ميكرولترا من كاشف التعداء إلى الحمض النووي. استخدم ماصة لخلط الحمض النووي وكاشف الإرسال بعناية، واتركه يقف لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، أضف خليط تعداء الحمض النووي على الخلايا المصنفة.

حرك الألواح برفق. واحتضان عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية لمدة يوم. احصد الفيروس الذي يحتوي على مادة طافية بعد 24 و 48 ساعة عن طريق تمريره عبر مرشح 0.22 ميكروميتر.

وتناول 1.6 مل من المادة الطافية في كل قارورة تبريد. بعد ذلك ، قم بشفط الخلايا الطافية وإعادة تعليق الخلايا Ba / F3 في الوسائط عن طريق سحب الخلايا لأعلى ولأسفل عدة مرات. أضف 500 ميكرولتر من الخلايا المعلقة ، و 1.5 مل من المادة الطافية الفيروسية ، وأربعة ميكرولتر من البوليبرين ، و 10 نانوغرام لكل مليلتر من إنترلوكين الفئران 3 في صفيحة زراعة أنسجة بستة آبار.

قم بالطرد المركزي للوحة عند 440 جم لمدة 120 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي ، انقل اللوحة إلى حاضنة للحضانة طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا عند 440 جم لمدة ثلاث دقائق.

وأعد تعليقها في خمسة ملليلتر من الوسائط الدافئة الطازجة في طبق بستة آبار. لتحديد الخلايا المصابة ب Cas9 ، قم أولا بتدوير الخلية. ثم يعاد تعليقها في وسائط دافئة طازجة مكملة بخمسة ميكروغرام لكل مليلتر من بلاستيسيدين بعد 48 ساعة من التطهير.

استمر في اختيار الخلايا لمدة تسعة أيام مع بلاستيسيدين حتى تموت جميع الخلايا غير المصابة. ثم انقل الخلايا المقاومة إلى وسط يحتوي على ميكروغرام واحد لكل مليلتر من بلاستيسيدين. قم بنقل الخلايا الأبوية والخلايا التي تعبر بثبات عن Cas9 باستخدام مراسل pXPR-011 من خلال عدوى الفيروسات العدسية.

استمر في اختيار الخلايا التي تحتوي على ميكروغرامين لكل مليلتر من البيورومايسين لمدة ثلاثة أيام ، بعد 48 ساعة من الالتهاب. إصابة الخلايا التي تعبر عن Cas9 بحمض نووي ريبي واحد باستخدام فيروس العدس. بعد ذلك ، استخدم ميكروغرامين لكل مليلتر من البيرومايسين لتحديد الخلايا لمدة ثلاثة أيام ، بعد 48 ساعة من التزيين.

في سلة المهملات ، الخلايا Ba / F3 التي تنمو بشكل كبير ، والتي تعبر عن Cas9 خارج الرحم ، والحمض النووي الريبي الدليل الفردي ذي الأهمية. شفط المادة الطافية واغسل الخلايا بخمسة ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات. قم بتدوير الخلايا لأسفل ، واغسلها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات ثلاث مرات.

بعد ذلك ، احسب عدد الخلايا باستخدام محلل بقاء الخلية. بعد ذلك ، خلايا البذور في ثلاث نسخ في ملليلترين من الوسائط الطازجة بدون إنترلوكين 3 في ستة ألواح ثقافة بئر. ابدأ في مراقبة وعد الخلايا كل يومين لمدة ثمانية أيام.

تظهر هنا بيانات القياس النفسي للتدفق التمثيلي التي توضح نشاط Cas9 في خلية Ba / F3 الأبوية و Ba / F3 التي تفرط في التعبير عن خلايا Cas9. يتم تقليل إشارة البروتين الفلوري الأخضر بنسبة 76٪ في Ba / F3 مما يؤدي إلى الإفراط في التعبير عن خلايا Cas9 ، مما يشير إلى نشاط قوي ل Cas9 ، بينما في خلايا Ba / F3 الأبوية ، تظل إشارة البروتين الفلوري الأخضر عند منحنيات نمو تمثيلية بنسبة 100٪ للخلايا التي تظهر نشاط الأورام للكالريتيكولين موضحة هنا. تم إدخال طفرة تحول إطار CRISPR / Cas9 بوساطة زوج أساسي واحد في موضع exon تسعة من calreticulin باستخدام m1 و m2 دليل واحد RNase.

تظهر منحنيات النمو لخلايا مستقبلات الثرومبوبويتين Ba / F3 التي تستهدف خلايا Cas9 نموا مستقلا للفئران إنترلوكين 3. ومع ذلك ، فإن منحنيات النمو لأنواع الخلايا الأخرى لا تظهر أي نمو مستقل عن السيتوكين. تؤكد نتائج التسلسل التحرير المستهدف لإكسون الكالريتيكولين الأندوجين تسعة في خلايا مستقبلات الثرومبوبويتين Ba / F3 المستهدفة Cas9 باستخدام m1 و m2 RNase أحادي التوجيه.

يشار إلى طفرات إزاحة إطار الزوج الأساسي الزائد باللون الأسود. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أسبوعين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم فهم نوع الطفرات في الجين المعني التي قد تكون مسؤولة عن النمط الظاهري المطلوب.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى لتوصيف الطفرة بشكل أكبر ، مثل دورها في إشارات الخلية أو في تفاعلات البروتين البروتيني من أجل فهم الآلية التي تسبب المرض بشكل أكبر. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أمراض الدم لاستكشاف تأثير طفرات اكتساب الوظيفة على المستويات الفسيولوجية على تحول الخلايا في خلايا المكونة للدم Ba / F3. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام منهجية تحرير الجينات CRISPR / Cas9 للتحقيق في النشاط المسرطن لطفرات اكتساب الوظيفة في الخلايا المكونة للدم المعتمدة على السيتوكين.

لا تنس أن العمل مع فيروس العدسات يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل العمل في منشأة BL2 plus أثناء تنفيذ هذا الإجراء.