جمع واستخراج عينات من الهواء المهنية لتحليل الحمض النووي الفطرية

الهدف العام من منهجية أخذ عينات الهواء واستخراج الحمض النووي هو الحصول على الحمض النووي الجيني الفطري الذي يمكن تضخيمه وتسلسله ووضعه تصنيفيا لتحديد المخاطر الفطرية المحتملة داخل البيئات المهنية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تقييم التعرض المهني ، مثل المخاطر الفطرية التي يتعرض لها العمال والتي قد تؤدي إلى آثار صحية سلبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن توضيح الأنواع الفطرية التي لا تزال غير مكتشفة باستخدام طرق الاستزراع أو الفحص المجهري باستخدام الأساليب القائمة على التسلسل.

لتجميع كاسيت مرشح أخذ عينات الهواء ، ضع وسادة دعم مرشح السليلوز على السطح الشبكي للقطعة الأساسية ، ثم بمساعدة ملقط المرشح ، ضع مرشحا أعلى وسادة دعم المرشح بحيث يكون جانب التجميع متجها لأعلى. بعد التجميع ، أغلق كاسيت المرشح عن طريق إدخال قلنسوة التمديد والضغط عليها بإحكام وبشكل متساو باستخدام مكبس يدوي أو هوائي. بعد ذلك ، قم بتركيب الكاسيت المجمع أعلى جهاز أخذ عينات الهباء الجوي NIOSH وادفع لأسفل قدر الإمكان.

استخدم قطعة من شريط لاصق مقاس 19 ملم للالتفاف حول الجزء الخارجي من علبة المرشح وجهاز أخذ العينات ، مع تثبيت علبة المرشح في مكانها وتعمل كمانع تسرب احتياطي لمنع التسرب. قم بربط أنابيب التجميع بإحكام وبشكل كامل في جهاز أخذ العينات حتى يتم لفها ولف شريط الختم حول الأنابيب ، مما يعمل كختم ثانوي ضد التسرب. لإجراء أخذ عينات شخصية من الهباء الجوي، ضع جهاز أخذ العينات داخل منطقة تنفس الشخص.

قم بتوصيل جهاز أخذ العينات بطية صدر السترة أو الكتف أو الصدر ثم احتفظ بمضخة أخذ العينات على مستوى الخصر أو في حقيبة الظهر. قم بتشغيل المضخات وتحقق بعد دقيقة مما إذا كانت المضخة تعمل. عند الانتهاء من أخذ عينات الهواء ، اجمع جهاز أخذ عينات الهواء من الموضوع.

قم بإزالة شريط الختم ، وفك الأنابيب ، ثم ضع غطاء عليها. ضع القطعة الثالثة من كاسيت الفلتر فوق الفلتر. أولا ، امسح كاسيت أخذ العينات بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم استخدم أداة فتح الكاسيت لفتح كاسيت أخذ العينات أثناء العمل في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.

بعد ذلك ، استخدم رافع المرشح لرفع وسادة الدعم والتصفية لأعلى. بعد ذلك ، استخدم ملقط المرشح لإزالة الفلتر ووضعه في طبق بتري معقم. قم بتقطيع الفلتر إلى ست قطع متساوية بمشرط معقم ثم ضعها في أنبوب مقوى سعة ملليلتر يحتوي على 300 ملليغرام من 200 إلى 500 ميكرومتر من الخرز الزجاجي.

اغمر الأنبوب المحتوي على المرشح في النيتروجين السائل لمدة 30 ثانية ثم ضعه بسرعة في خالط مطحنة الخرزة بسرعة 4.5 متر في الثانية لمدة 30 ثانية. أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت للتحلل إلى الأنابيب التي تحتوي على القطع الصغيرة المتبقية من المرشح السليم ، ثم أضف 0.3 مليلتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى أنابيب تجميع عينات الهواء 15 و 1.5 مليلتر ودوامة الأنابيب في وضع مستقيم ومقلوب لمدة 10 إلى 15 ثانية على التوالي. انقل المخزن المؤقت للتحلل من كل أنبوب تجميع إلى أنابيب مقواة بسعة ملليلتر تحتوي على 300 ملليغرام من الخرز الزجاجي.

قم بمعالجة الأنابيب في الخالط مطحنة الخرزة لمدة 30 ثانية ، ثم قم بالطرد المركزي للعينات عند 20،000 مرة من الجاذبية لمدة دقيقة واحدة عند 22 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بنقل المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 ملليلتر وقم مرة أخرى بالطرد الطافي عند 20،000 مرة من الجاذبية لمدة دقيقة واحدة عند 22 درجة مئوية. بعد إضافة 30 ميكرولتر من كاشف التحلل ، احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

ثم أضف 0.2 ملليلتر من المخزن المؤقت الملزم و 100 ميكروغرام لكل مليلتر من البروتيناز K إلى الأنبوب ، ثم اترك الأنابيب للحضانة في سخان كتلة عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أخيرا ، أضف 100 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى كل أنبوب. بعد ذلك ، ضع أنابيب ترشيح الألياف الزجاجية بسعة 700 ميكرولتر في أنابيب تجميع ملليلتر ونقل محاليل الاستخراج إليها.

بعد النقل ، قم بالطرد المركزي لأنابيب التجميع عند 20،000 مرة من الجاذبية لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي ، أدخل ألياف المرشح الزجاجي في أنابيب التجميع الطازجة وتخلص من أنبوب التجميع. أضف إلى كل أنبوب 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت لإزالة المثبط وقم بإجراء الطرد المركزي عند 20،000 مرة من الجاذبية لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية.

تخلص من أنبوب التجميع بعد الطرد المركزي وضع أنابيب الترشيح في أنابيب تجميع جديدة. ثم أضف 0.5 مل من محلول الغسيل إلى كل أنبوب ويخضع مرة أخرى للطرد المركزي عند 20،000 ضعف الجاذبية لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية. تخلص من أنبوب التجميع واستبدله بأخرى جديدة بعد الطرد المركزي.

مرة أخرى ، أضف 0.5 مل من محلول الغسيل إلى كل أنبوب وجهاز طرد مركزي عند 20،000 ضعف الجاذبية لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية. لإزالة أي مخزن مؤقت للغسيل المتبقي ، أخيرا ، قم بالطرد المركزي لأنابيب التجميع عند 20،000 مرة من الجاذبية لمدة دقيقة واحدة عند 22 درجة مئوية وتخلص من أنابيب التجميع واستبدلها بأخرى جديدة. بعد إضافة 100 ميكرولتر من محلول الشطف الدافئ ، قم باحتضان الأنابيب الموجودة على مقعد المختبر في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة إلى دقيقتين وقم بالطرد المركزي لأنابيب التجميع عند 20،000 مرة من الجاذبية لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية.

ضع أنابيب المرشح في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مليلتر وأعد تطبيق المواد المشطوة لجهاز طرد مركزي دائري آخر. استخدم أنابيب PCR سعة 0.5 ملليلتر لإعداد تفاعلات سعة 50 ميكرولتر في ثلاث نسخ مع خمسة ميكرولترات من الحمض النووي المستخرج بالفعل لكل تفاعل ، ثم قم ببرمجة جهاز التحكم الحراري وابدأ الدورة. امزج جميع تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل الثلاثة معا في أنابيب معقمة 1.5 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة.

أضف 750 ميكرولترا من المخزن المؤقت للربط واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات. أضف 450 ميكرولترا من الخليط الكلي لتدوير الأعمدة التي يتم إدخالها في أنابيب التجميع وابدأ في الطرد المركزي عند 17،900 مرة من الجاذبية لمدة 30 ثانية ، ثم تخلص من المرشح وأضف 450 ميكرولترا المتبقية من الخليط لجولة ثانية من الطرد المركزي. مرة أخرى ، تخلص من المرشح وأضف 750 ميكرولترا من محلول الغسيل إلى أعمدة الدوران وأجهزة الطرد المركزي عند 17،900 ضعف الجاذبية لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية.

أخيرا ، تخلص من الترشيح وأعد تدوير الأعمدة الفارغة عند 17،900 ضعف الجاذبية لمدة دقيقة واحدة عند 22 درجة مئوية. بعد نقل أعمدة الدوران إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المعقمة سعة 1.5 ملليلتر ، قم بتعبئة 45 ميكرولترا من محلول الشطف واحتضان الأنابيب الموجودة على مقعد المختبر في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأعمدة عند 17،900 ضعف الجاذبية لمدة دقيقة واحدة عند 22 درجة مئوية.

اغمر هلام الاغاروز بنسبة 1٪ في محلول TAE ذو طية واحدة في غرفة الرحلان الكهربائي ، ثم امزج ميكرولترين من مخزن التحميل المكون من خمسة أضعاف مع ثمانية ميكرولترات من الحمض النووي المضخم. أخيرا ، قم بتحميل 10 ميكرولترات كاملة من العينة على الجل مع سلم الحمض النووي. قم بتشغيل الجل على 75 فولت لمدة 90 دقيقة تقريبا.

يوضح هلام الاغاروز التمثيلي تضخيم مناطق الفاصل الداخلية المنسوخة للحمض النووي الجيني الفطري المشتق من عينات الهواء المهنية. يمثل الممر الموجود على أقصى الجانب الأيسر ممر علامة الحمض النووي. تمثل العصابات الموجودة على اليمين مناطق الفاصل المكتوبة الداخلية التي تم تضخيمها من عينات هواء مهنية مختلفة بأحجام تتراوح من 750 إلى 1,000 زوج قاعدة.

يظهر مخطط Krona التمثيلي وجود أنواع فطرية تصنيفية متنوعة في بيئة داخلية. تم استخدام جهاز أخذ عينات الإعصار الحيوي NIOSH في المنازل لجمع الهباء الجوي الحيوي لمدة ساعة واحدة لتحديد الأنواع الفطرية الموجودة. تمثل البيانات الجدولية مؤشرات تنوع وثراء الأنواع الفطرية في البيئات الداخلية.

تظهر البيانات مؤشرات ثراء Chao-1 أعلى ، ومؤشرات تنوع شانون ، ومعاملات اختلاف Bray-Curtis في بيئات التبريد التبخيري المكيفة والتبخيرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية جمع عينات الهواء الداخلية والمهنية واستخراج الحمض النووي الجيني لتحليل التجمعات الميكروبية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام أفضل الطرق المعقمة لمنع التلوث الميكروبيولوجي للعينات.