أسلوب نقل تتسم بكفاءة في المختبر بنظام جمال النوم ترانسكريبتيونالي الخاضعة للتنظيم في متجه تكامل لينتيفيرال معيبة وتعبئتها

الهدف العام من هذه الطريقة هو تحقيق تكامل مستقر للجين ذي الأهمية في الجينوم البشري للخلايا الأولية من خلال نظام الجمال النائم المنظم النسخي المعبأ في ناقلات الفيروسات العسقرية المعيبة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال العلاج الجيني مثل دمج الجين محل الاهتمام في الخلايا الأولية باستخدام نظام الجمال النائم. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أن نظام الجمال النائم مفرط النشاط المحفز يوفر بكفاءة خلايا أولية مقاومة للعديد من طرق التعداد.

ستظهر الإجراء دانييلا بيناتي ، طالبة ما بعد الدكتوراه في مختبري. قبل يوم التنبيغ ، تزرع الخلايا الكيراتينية الأولية البشرية كما هو موضح في بروتوكول النص. لفصل الخلايا الكيراتينية الفرعية المتشابكة في الثقافة ، قم بإزالة الوسط ، وغسل الخلايا باستخدام 1X PBS ، وأضف مليلتر واحد من محلول عمل التربسين الدافئ مسبقا إلى كل بئر.

احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا. أعد تعليق خلايا البئر جيدا وانقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على ملليلترين من الوسط المحتوي على المصل. اشطف البئر مرة واحدة بثلاثة ملليلتر من 1X PBS وأضف المحلول المغسول إلى أنبوب الطرد المركزي مع تعليق الخلية.

جهاز طرد مركزي عند 580 مرة جم لمدة خمس دقائق وتخلص من المادة الطافية. اغسل الخلايا بخمسة ملليلتر من 1X PBS ، وجهاز الطرد المركزي بمعدل 580 مرة جم لمدة خمس دقائق ، وتخلص من المادة الطافية. في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 ملليلتر ، قم بتخفيف 1.6 مرة 10 إلى الخلايا الكيراتينية الخامسة في مليلتر واحد من وسط CFAD.

قم بإعداد تخفيف واحد لكل حالة. تم إعداد نواقل العدسي أو IDLV الثلاثة المعيبة في وقت سابق كما هو موضح في بروتوكول النص. يحمل IDLVTKSB عمليات تبديل SB100X مفرطة النشاط المنظمة من TET.

يحمل رموز IDLVrtTA للمغير و IDLVT2 الجين محل الاهتمام. GFP في هذا المثال محاط بتكرارات الينقولات المقلوبة. تمييع نواقل الفيروسات العدسية في مليلتر واحد من وسط CFAD في وجود 20 ميكرولتر من البوليبرين كما هو موضح في هذا الجدول.

واحد واثنان وثلاثة هي عناصر تحكم سلبية بدون متجهات. أربعة وخمسة تحتوي على IDLVTKSB و IDLVrtTA. تحتوي ستة وسبعة وثمانية وتسعة على جميع نواقل الفيروسات العدسية الثلاثة.

قم بتحويل الخلايا في حالة تعليق عن طريق إضافة كل تخفيف ناقل فيروسي إلى تعليق الخلايا الكيراتينية المقابل. قم بإزالة الوسط من خلايا التغذية 3T3-J2 المعرضة للإشعاع المميت والتي انحسرت قبل يوم واحد وقم بطلاء الخلايا الكيراتينية المنقولة عليها. بعد تحويل البئر ، تابع البئر التالي.

احتضن على حرارة 25 درجة لمدة 30 دقيقة. ثم انقل الخلايا إلى 37 درجة لمدة ست ساعات. بعد ست ساعات ، أضف ملليلتر واحد من وسط CFAD إلى كل بئر.

أضف ميكرومولار واحدا من الدوكسيسيكلين إلى الآبار الخامسة والثامنة والتاسعة. إرجاع الخلايا إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بمعالجة الخلايا في كل بئر كما هو موضح في بروتوكول النص.

لتحليل الفلور الخلوي ، يجب تمييز الخلايا الكيراتينية الأولية المنقولة التي تم فصلها في اليوم الثالث واليوم السادس عن طبقة التغذية 3T3-J2 عن طريق تسمية الخلايا بجسم مضاد مضاد للتغذية أحادي النسيلة APC أحادي النسيلة للفأر. قم بإعداد أربعة ملليلتر من المخزن المؤقت للتلوين لكل عينة عن طريق الجمع بين 5٪ FBS و 500 مللي مولار EDTA و 1X PBS. اغسل الخلايا المنفصلة بملليلتر واحد من المخزن المؤقت للتلطيخ.

جهاز طرد مركزي عند 580 مرة جم لمدة خمس دقائق وتخلص من المادة الطافية. في أنبوب لاكتساب قياس التدفق الخلوي ، أعد تعليق خمس مرات 10 إلى الخلايا الرابعة في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ. أضف ميكرولترين من الجسم المضاد للتغذية عند تخفيف واحد إلى 50 واخلطه جيدا.

احتضن على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، اغسل بملليلترين من المخزن المؤقت للتلطيخ. جهاز طرد مركزي عند 580 مرة جم لمدة خمس دقائق.

تخلص من المادة الطافية وأعد تعليقها في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ. استخدم مقياس التدفق الخلوي الذي تم تكوينه باستخدام ليزر أزرق وليزر أحمر ومرشحات للكشف عن مضان GFP و APC للحصول على إشارات APC و GFP. يشير جزء الخلية الإيجابي GFP من مجموعة الخلايا السلبية APC إلى الخلايا الكيراتينية المنقولة.

لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، قم بإعداد التفاعلات بثلاث نسخ في صفيحة 96 بئرا في حجم تفاعل نهائي يبلغ 25 ميكرولترا. يحتوي كل تفاعل على ميكرولتر واحد من الحمض النووي (cDNA) ، و 12.5 ميكرولتر من مزيج رئيسي 2X ، و 1.25 ميكرولتر من البادئات في مزيج مسبار 20X ، و 10.25 ميكرولتر من الماء المعقم. قم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي وفقا لبرنامج PCR هذا ، دورة واحدة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم 40 دورة 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة واستمر عند أربع درجات مئوية.

أخيرا ، قم بتحليل بيانات PCR في الوقت الفعلي كما هو موضح في بروتوكول النص. أظهر تحليل التعبير لخلايا HeLa المنقولة مع زيادة جرعات التبديل في نواقل المعدل بالإضافة إلى أو ناقص الدوكسيسيكلين أن الجرعات العالية من كل من IDLVs كانت مطلوبة للحث بقوة على تعبير SB100X. كشف التحليل الكمي لتعبير SB100X على خلايا HeLa المنقولة مع ناقل التبديل في وجود أو عدم وجود ناقل المغير عن تنشيط ثمانية أضعاف على الخلفية في وجود الدوكسيسيكلين.

يمكن أيضا استخدام نظام الجمال النائم المنظم للنسخ في الخلايا الأولية. أظهر تعبير SB100X على الخلايا الكيراتينية المنقولة مع التحويلات ونواقل المغير تنشيطا بمقدار 15 ضعفا على حالة إيقاف التشغيل. أشارت تجربة التبديل التي أجريت في الخلايا الكيراتينية المنقولة مع نواقل IDLV الثلاثة بالإضافة إلى أو ناقص الدوكسيسيكلين إلى أن 12٪ من الخلايا المعالجة بالدوكسيسيكلين دمجت بثبات نسخة واحدة على الأقل من GFP في جينومها.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء النقل الحيوي في الخلايا الأولية في ثماني ساعات ، والتحليل الخلوي فلوري في ساعتين ، وتحليل التعبير في ثلاث ساعات إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحسين تركيبة جرعة النواقل المستخدمة لتحويل الخلايا الأولية وتحقيق مستوى تعبير أعلى من عمليات تبديل الجمال النائم المحفزة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي وتفاعل البوليميراز المتسلسل بوساطة الرابط من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل رقم نسخة الينقولات لكل خلية والتكامل في حفظ الجينوم.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحث في مجال العلاج الجيني لاستكشاف تطبيق نظام الجمال النائم في هندسة الخلايا السريرية ذات الصلة. بعد مشاهدة الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحويل الخلايا الكيراتينية الأولية أولا باستخدام نواقل IDLV. ثانيا ، قم بقياس التعبير عن الانتقالات مفرطة النشاط عند حالة الدوكسيسيكلين وأخيرا اتبع التبديل عن طريق قياس التدفق الخلوي.

لا تنس أن العمل مع النواقل الفيروسية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، لذا يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل BCL لاحتواء المستوى والإمداد القابل للتصرف معك أثناء تنفيذ هذه الإجراءات.