العزلة، والثقافة، وتمايز الخلايا اللحمية في النخاع العظمى وفروعه اوستيوكلاست من الفئران

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وزراعة الخلايا اللحمية لنخاع العظم ، أو BMSCs. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات العظام والخلايا الشحمية حول الخلايا السلفية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن عزل BMSCs بطريقة سريعة نسبيا وقابلة للتكرار وغير مكلفة.

العرض المرئي لهذه الطريقة مفيدا ، حيث قد يكون من الصعب شرح خطوات التشريح بالنص وحده. قبل البدء في إجراء حصاد العظام ، أضف 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الجذعية لنخاع العظم في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل لكل ثلاث عظام يتم حصادها. وقم بقص الطرف من طرف ماصة واحد سعة 200 ميكرولتر لكل أنبوب طرد مركزي دقيق ، بحيث يمكن وضع كل طرف في أنبوب واحد مع إغلاق الأغطية.

بعد ذلك ، ضع أول فأر قتل رحيم يبلغ من العمر 78 أسبوعا في وضع ضعيف على لوح تشريح ورش بنسبة 70٪ من الإيثانول. استخدم الملقط لإنشاء خيمة من الجلد على البطن ، واستخدم مقص تشريح معقم لعمل شق جلدي بطول سنتيمتر واحد تقريبا. قشر الجلد لكشف أسفل البطن والساقين.

اقطع على طول القمة الحرقفية لكل ورك لفصل رؤوس عظم الفخذ عن الحوض ، وقم بعمل شق عبر خط الوسط للحوض لفصل العظام الحرقفية ، وقطع أسفل مفاصل الكاحل لإزالة القدمين. ثم افصل الساق عن عظم الفخذ عن طريق قطع مفصل الركبة. بعد ذلك ، استخدم مناديل خالية من النسالة لإزالة العضلات بعناية من عظم الفخذ والساق والعظام الحرقفية.

عندما يتم جمع جميع العظام ، ضع العينات في PBS على الجليد ، وانقل العينات إلى غطاء مزرعة معقم. باستخدام تقنية معقمة ، قم بعمل قطع من واحد إلى ملليمترين في كل من الأطراف القريبة والبعيدة لكل عظم قبل وضع ثلاث عظام في كل طرف ماصة دقيقة معدلة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. احصد نخاع العظم من العظام عن طريق الطرد المركزي ، مع التأكد مما إذا كان النخاع قد تم تكويره بالكامل إلى قاع كل أنبوب طرد مركزي دقيق في نهاية الدوران.

إذا تم جمع كل النخاع ، فستظهر العظام بيضاء. قم بإزالة أطراف الماصات الدقيقة والعظام من أنابيب التجميع للتخلص السليم من السلامة البيولوجية. لصفيحة خلايا نخاع العظم ، استخدم أولا حقنة سعة مليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 25 لإعادة تعليق الكريات ببطء وتفتيت أي كتل ، وتجميع العينات في أنبوب مخروطي واحد سعة 15 ملليلترا.

أضف 10 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا الجذعية لنخاع العظم لكل 500 ميكرولتر من العينة ، وقم بتصفية معلق الخلية من خلال مرشح 70 ميكرون في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر لإزالة أي شظايا عظمية. بعد العد ، قم بزرع خلايا نخاع العظم مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل سنتيمتر مربع في وسط استزراع طازج لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الثالث ، استبدل المادة الطافية بوسط جديد ، وقم بتغيير الوسط كل يومين بعد ذلك حتى تصل الخلايا إلى 80٪ إلى 100٪.

لصفيحة مزرعة خلايا نخاع العظم المنقسمة ، قم بوضع خلايا نخاع العظم المحصودة من فأر واحد في طبق زراعة خلية بطول 10 سم لمدة 48 ساعة في وسط مزرعة طازجة في حاضنة زراعة الخلايا. في اليوم الثاني من الثقافة ، قم بإزالة المادة الطافية المحتوية على الخلايا الجذعية المكونة للدم غير الملتصقة ، واغسل اللوحة بعناية باستخدام PBS ، دون إزعاج خلايا نخاع العظم الملتصقة. استبدل PBS ب 0.25٪ تريبسين.

بعد دقيقة إلى ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية ، قم بإخماد التفاعل باستخدام وسط زراعة الخلايا الطازجة ، واحسب الخلايا في تعليق الخلية الناتج. الطرد المركزي العدد المناسب من الخلايا للطلاء ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط ثقافة طازج كاف لكثافة الطلاء المطلوبة. ثم ضع الألواح في حاضنة زراعة الخلايا حتى التقاء.

للحث على تمايز الخلايا العظمية لنخاع العظم ، استبدل وسط زراعة الخلايا بوسط التمايز كل يومين ، حتى تبدأ الخلايا في إنتاج عقيدات بيضاء من التمعدن يمكن ملاحظتها مجهريا. للحث على تمايز الخلايا الشحمية للخلايا الجذعية لنخاع العظم ، استبدل وسط زراعة الخلايا لزراعة خلايا نخاع العظم المتقاربة بوسط تحريض الخلايا الشحمية. بعد يومين من الاستزراع ، استبدل المادة الطافية بوسط تحريض الخلايا الشحمية الطازجة ، وقم بالتبديل إلى وسط قاعدة الخلايا الشحمية في اليوم الرابع.

في اليوم السابع ، تأكد من أن الخلايا لديها قطرات دهنية متراكمة ، وأنها تعرض نمطا ظاهريا مشابها للخلايا الشحمية الناضجة. لتفريق الخلايا الجذعية المكونة للدم إلى ناقضات العظم ، عندما تصبح مزرعة خلايا نخاع العظم الكلية أو ثقافة الخلايا غير الملتصقة ملتصقة ، استبدل وسط زراعة الخلايا بوسط تمايز ناقضات العظم. قم بتغيير الوسط كل يومين ، وتحقق من تمايز ناقضات العظم يوميا تحت مجهر ضوئي بتكبير 10 أضعاف حتى تندمج ناقضات العظم وتشكل خلايا متعددة النوى ، عادة حوالي الأيام الخامسة إلى السابعة من التمايز.

يمكن تمييز الثقافات المتقاربة من BMSCs إلى بانيات العظم باستخدام وسط متولد العظم يتكون من حمض الأسكوربيك وبيتا جليسيروفوسفات. بعد بضعة أيام من التمايز ، تبدأ بانيات العظم في التعبير عن الفوسفاتيز القلوي. وسيؤدي المزيد من التمايز إلى إنتاج مصفوفة عظم العظام ، وفي النهاية تمعدن هذه المصفوفة.

ومن المثير للاهتمام ، أن نسبة فقط من الخلايا ستتمايز إلى بانيات العظم في المختبر ، كما يتضح من تلطيخ البنفسجي البلوري. سواء تم استخدام مجموعات مختلطة أو مجموعات خلايا نخاع العظم المنقسمة ، فإن نسبة فقط من الخلايا ستتمايز إلى خلايا شحمية ، والتي تظهر كخلايا مستديرة ذات فجوات دهنية متعددة يمكن تلطيخها بصبغة O الزيتية الحمراء. سوف تندمج مزارع الخلايا الجذعية البشرية المكملة بعامل تحفيز خلايا الفئران و RANKL بسرعة لتشكيل خلايا متعددة النوى تكون إيجابية ل TRAP.

ناقضات العظم هذه قادرة على امتصاص المصفوفة المعدنية في المختبر ، ويمكن استخدامها لتقييم نشاط العظم. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في أقل من ساعة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، اعتمادا على عدد الفئران. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تعقيم الأدوات وإعداد الوسائط مسبقا ، حتى تتمكن من العمل بأسرع ما يمكن وبأكبر قدر ممكن من التعقيم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا اللحمية لنخاع العظم وزراعتها.