تركيب 10 نانومتر فونكتيوناليزيد المغلفة البوليمر جزيئات الذهب لاستهداف البطانة وإيصال الأدوية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصنيع الكريات النانوية الذهبية المطلية بالبوليمر الوظيفية التي يبلغ قطرها 10 نانومتر ، ومتوافقة حيويا ، ولها وقت دوران ممتد ويمكن تصويرها باستخدام المجهر الفلوري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أمراض القلب حول نفاذية البطانة في ظل الظروف المرضية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تخلق جزيئات صغيرة جدا متوافقة حيويا تحتوي على مجموعات وظيفية متاحة لمزيد من التخصيص.

أولا ، في أنبوب الطرد المركزي الصغير ، قم بتخفيف 12 ميكرولتر من 80٪ THPC مع مليلتر واحد من الماء النقي للغاية. قم بتثبيت قارورة سفلية مستديرة سعة 100 مل فوق لوحة تحريك مغناطيسية. أضف إلى القارورة 45 مل من الماء وشريط تحريك صغير على شكل بيضة.

ابدأ في تقليب الماء عند 300 دورة في الدقيقة. أضف إلى القارورة 0.5 ملليلتر من محلول هيدروكسيد الصوديوم المولي الواحد ، ومليلتر واحد من محلول THPC المخفف. استمر في تقليب خليط التفاعل بقوة لمدة خمس دقائق.

ثم أضف ملليلترين من محلول حمض الكلوروريك 25 ملليمولار إلى خليط التفاعل أثناء التحريك. تأكد من أن خليط التفاعل الأصفر يصبح بنيا داكنا في غضون ثوان ، مما يشير إلى تكوين جزيئات ذهبية صاببة الشحنة ذات غطاء THPC. استمر في تقليب الخليط لمدة 15 دقيقة.

أثناء تحريك الخليط ، قم بإعداد محلول مائي من أمين PEG ثيول غير متجانس وظيفي ، وكربوكسي ميثيل PEG ثيول ، وميثوكسي PEG ثيول أحادي الوظيفة. بمجرد تقليب خليط تفاعل الجسيمات النانوية الذهبية لمدة 15 دقيقة ، قلل سرعة التقليب إلى 100 دورة في الدقيقة. أضيفي محاليل PEG إلى الخليط أثناء التحریک.

استمر في تقليب الخليط برفق طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أغلق أحد طرفي غشاء السليلوز MWCO 12-14 كيلودالتون بمشبك غسيل الكلى. استخدم ماصة لنقل خليط التفاعل إلى الغشاء.

أغلق الطرف الآخر من الغشاء بمشبك غسيل كلىوي ثان. غسيل خليط الجسيمات النانوية مقابل أربعة لترات من الماء مع التقليب عند 60 دورة في الدقيقة لمدة 72 ساعة. قم بتغيير الماء كل ساعتين خلال الساعات الست الأولى ، وكل ست إلى 12 ساعة بعد ذلك.

بعد ذلك ، قم بتصفية خليط الجسيمات النانوية الذهبية شبه المنقى من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر ، في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. قم بتجميد محلول الجسيمات النانوية المنقى عند سالب 80 درجة مئوية لمدة خمس ساعات تقريبا. قم بتجميد الجسيمات النانوية المنقاة باستخدام مجفف التجميد.

لبدء تحضير جزيئات الذهب النانوية الفلورية ، قم بتثبيت قارورة سفلية مستديرة سعة 100 مل فوق لوحة تحريك مغناطيسية. أضف 18 مل من الماء النقي للغاية وقضيب تقليب صغير على شكل بيضة إلى القارورة ، وابدأ في التقليب عند 100 دورة في الدقيقة. في أنبوب مخروطي الشكل سعة أربعة ملليلتر ، امزج ملليغرامين من جزيئات الذهب النانوية المجففة بالتجميد مع ملليلترين من الماء.

بعد ذلك ، انقل محلول الجسيمات النانوية إلى القارورة السفلية المستديرة لمزيد من إعادة التكوين. أضف ملليلترا واحدا من الرقم الهيدروجيني 8.8 ، 0.1 مولار من الكربونات إلى الجسيمات النانوية المعاد تكوينها أثناء التحريك. ثم أضف خمسة ميكرولترات من محلول 10 ملليغرام لكل مليلتر من إستر أنهيدروكسي سوكسينيميد الفلورسنت في ثنائي ميثيل سلفوكسيد.

لف القارورة بورق الألمنيوم لاستبعاد الضوء تماما. استمر في تقليب خليط الجسيمات النانوية الفلورية طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بغسيل الخليط بكميات كبيرة مقابل أربعة لترات من الماء لمدة 72 ساعة باستخدام الإجراء الموصوف في تحضير جزيئات الذهب النانوية المبتذلة.

احتفظ بالحاوية مغطاة بورق الألمنيوم طوال عملية غسيل الكلى. ضع جانبا ملليلترا واحدا من الجسيمات النانوية الفلورية المنقاة للتوصيف. قم بتجميد وتجميد وتخزين الجسيمات النانوية الفلورية المتبقية عند أربع درجات مئوية.

لتصور قلب الجسيمات النانوية الذهبية باستخدام الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال ، ضع أولا 10 ميكرولترات من محلول الجسيمات النانوية الفلورية المنقى على شبكة TEM شبكية مطلية بالكربون. اترك القطرة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، استخدم ورق الترشيح لإزالة السوائل الزائدة بعناية من حافة شبكة TEM ، حتى يبقى فيلم فقط من الجسيمات النانوية الفلورية على الشبكة.

قم بتصوير الجسيمات النانوية عند 80 كيلو فولت ، بتكبير من 50،000 إلى 150،000. لقياس حجم الجسيمات النانوية الهيدروديناميكية ، ضع ملليغراما واحدا من جزيئات الذهب النانوية المطلية ب THPC المجففة بالتجميد في أنبوب طرد مركزي صغير. أضف ملليلترا واحدا من الماء إلى كل أنبوب ، وانقل المحاليل إلى مليلتر واحد من الكوفيت البلاستيكي الشفاف.

قم بتقييم كل محلول مع تشتت الضوء الديناميكي ، وقياس الأقطار الهيدروديناميكية الكروية للجسيمات. بعد ذلك ، انقل الكوفيت الذي يحتوي على جزيئات الذهب النانوية الفلورية إلى مقياس الطيف الفلوري. اضبط الطول الموجي للانبعاث على 633 نانومتر ، واقرأ إشارات الانبعاث من 650 إلى 800 نانومتر.

بعد ذلك ، لتقييم التوافق الحيوي عند 7 تركيزات من الجسيمات النانوية ، الماصة الأولى 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا البطانية للوحة دهون الفئران في DMEM في كل من 21 بئرا من 96 صفيحة معالجة بثقافة الأنسجة المعقمة ذات القاع الشفاف جيدا. احتضان الخلايا حتى يتحقق التقاء ، ثم احصل على سبعة محاليل من الجسيمات النانوية الفلورية في DMEM بتركيزات تتراوح من صفر إلى 1000 ميكروغرام لكل ملليلتر. استنشق DMEM من الآبار.

ضع 100 ميكرولتر من كل محاليل من محاليل الجسيمات النانوية السبعة في كل من الآبار المنفصلة في ثلاث نسخ. اسمح للخلايا والجسيمات النانوية بالتحتضن لمدة 16 ساعة. بعد ذلك ، قم بشفط DMEM والجسيمات النانوية المعلقة أو المتصلة بشكل فضفاض من الآبار.

أضف 100 ميكرولتر من DMEM الطازج الذي يحتوي على 20 ميكرولتر من محلول MTS / PES لكل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد ذلك ، قم بتقييم صلاحية الخلية عن طريق تحليل الكلورومترية عند 492 نانومتر باستخدام قارئ اللوحة.

بعد ذلك ، تنزلق الخلايا البطانية للوحة الدهون في الفئران على غطاء زجاجي معقم سعة 12 مليلتر عند 10 ، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع. تغذية الخلايا ب DMEM المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. احتضان الخلايا حتى يتحقق التقاء كامل.

قم بتعديل الجليكوكاليكس البطاني إذا رغبت في ذلك ، ثم احتضان الخلايا ب 550 ميكروغرام لكل مليلتر من جزيئات الذهب الفلورية النانوية لمدة 16 ساعة. تحضير الخلايا للفحص المجهري المناعي. قم بتركيب كل زلة غطاء على شريحة مجهرية مع وسيط تركيب مضاد للبهتان يحتوي على DAPI.

أغلق حواف انزلاق الغطاء بطلاء الأظافر. قم بتصوير الخلايا البطانية الملطخة بالمناعة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. تصور النوى ، جليكوكليكس كبريتات الهيبارين ، والجسيمات النانوية ذات القنوات الزرقاء والخضراء والحمراء البعيدة ، على التوالي.

أظهر TEM من الجسيمات النانوية الذهبية المطلية ب THPC أقطار جسيمات تتراوح من اثنين إلى ثلاثة نانومتر. يمكن أن يؤكد TEM للجسيمات النانوية المبتثرة فقط وجود الجسيمات المتناثرة ، حيث أن PEG غير مرئي في صور TEM. أظهر DLS للجسيمات النانوية المطلية ب THPC والمغلفة تحولا في قطر ذروة الجسيمات من 2.5 نانومتر إلى 10.5 نانومتر.

كان الحد الأقصى للانبعاث الفلوري يتراوح بين 660 و 672 نانومتر عند إثارته بضوء 633 نانومتر ، وهو ما يتوافق مع الحد الأقصى المتوقع للانبعاث عند 665 نانومتر لمسبار الفلورسنت المستخدم. أظهرت الخلايا البطانية للوسادة الدهنية للفئران مستويات مماثلة من الجدوى بعد 16 ساعة من الحضانة المشتركة مع جزيئات الذهب النانوية المعجلة الفلورية بتركيزات تصل إلى ملليغرام واحد لكل مليلتر ، مما يشير إلى عدم وجود سمية كبيرة من الجسيمات النانوية. لوحظ الحد الأدنى من امتصاص الجسيمات النانوية في الخلايا البطانية لوسادة الدهون في الفئران مع جليكوكاليكس صحي.

حدث امتصاص أكبر بشكل ملحوظ في الخلايا ذات الجليكوكاليكس المتدهور كما يتضح من الزيادة في إشارات الفلورسنت الحمراء من الجسيمات النانوية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء مزيد من التعديل مثل الاقتران على المجموعات الوظيفية المفتوحة لتعديل الجسيمات لاستهداف محدد لمكون البطانة أو توصيل الدواء.