الآثار السلوكية والإنجابية الطويلة الأجل الجنينية التعرض لجرعة منخفضة سميات

الهدف العام من هذه الإجراءات هو التحقيق في الآثار طويلة المدى للتعرض لجرعة منخفضة من BPA في التطور الجنيني المبكر. تتعرض أجنة C.elegans ل BPA لفترة محدودة ويتم اختبارها عند بلوغها سن البلوغ من أجل الخصوبة وسلوك التعلم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالآثار التنموية طويلة المدى للتعرض للمواد السامة مثل بيسفينول وغيرها من المركبات المسببة لاضطراب الغدد الصماء.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح باختبار التأثيرات طويلة المدى والدقيقة للمواد السامة على التطور من خلال المقايسات السلوكية الكمية على نموذج مختبر اللافقاريات سهل الاستخدام. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو فهم الأساس التنموي والعصبي للآثار الصحية الضارة للتعرض للمواد السامة حتى عند الجرعات المنخفضة. خطرت لنا فكرة هذه التجارب لأول مرة عندما أدركنا أن عددا من الاضطرابات المعقدة أو متعددة العوامل يبدو أنها تحتوي على بعض المكونات التنموية أو الأخرى.

والتي قد تمارس تأثيرها جزئيا من خلال التعبير الشاذ للجينات الحرجة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث قد يكون من الصعب تعلم خطوات التعود على اللمس الداخلي فقط من خلال التعليمات المستندة إلى النص. في اليوم السابق للمزامنة ، انقل ديدان N2 إلى ألواح 100 ملم تحتوي على وسائط NGM ، وتنتشر باستخدام الإشريكية القولونية OP50.

عن طريق تقطيع بلاطة من حوالي سنتيمتر مربع واحد. اسمح للديدان بالنمو لمدة ثلاثة أيام عند 20 درجة مئوية. بعد ثلاثة أيام ، عندما تمتلئ الصفائح ببالغين ناضجين يتغذون جيدا ويحتويون على أجنة مرئية ، ابدأ التزامن عن طريق غسل كل لوحة أولا بخمسة ملليمترات من المخزن المؤقت M9 ، ونقل السائل إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم سعة 15 ملليلترا.

جهاز طرد مركزي عند 3 ، 000 مرة من الجاذبية لمدة أربع دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد ، استخدم ماصة سعة عشرة ملليلتر لإزالة المادة الطافية بعناية من كل حبيبات فضفاضة من الديدان البالغة. ثم أضف 5 مل من محلول هيبوكلوريت المحضر حديثا إلى كل حبيبات من الديدان ، واخلطها برفق.

جهاز طرد مركزي عند 3 ، 000 مرة من الجاذبية في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق. من الأهمية بمكان الحصول على مجموعات سكانية متزامنة. يساعد تحضير محلول هيبوكلوريت طازج في تجنب التلوث غير المتزامنة.

بعد ذلك ، استخدم ماصة سعة عشرة ملليلتر لإزالة المادة الطافية ، واغسل سبعة ملليلتر من المخزن المؤقت M9. كرر هذه الخطوة مرتين. بعد الغسيل الأخير ، أضف ما يقرب من 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 إلى البيض.

ثم انقل حوالي 50 ميكرولترا من البيض إلى أنبوبين من أجهزة الطرد الدقيقة تحتوي على BPA مخفف في المخزن المؤقت S. اضبط مقدار المخزن المؤقت S لضمان التركيز النهائي الصحيح ل BPA لكل أنبوب ، كما هو موضح في الجدول. ضع الأنابيب على شاكر هزاز أو دوار ، يتحرك بسرعة 25 إمالة في الدقيقة ، أو 25 دورة في الدقيقة لمدة أربع ساعات عند 20 درجة مئوية.

بعد أربع ساعات ، ضع الأنابيب في حاملات الأنابيب واترك الديدان تستقر. تخلص من المادة الطافية وانقل الديدان إلى ألواح NGM المصنفة ب OP50 E.coli. اترك الديدان تنمو لمدة 60 ساعة عند 20 درجة مئوية.

افحص الألواح كل يوم بحثا عن التلوث. عادة ما يتغير لون صفائح NGM الملوثة ويرافقها مستعمرات فردية. افحص الديدان تحت المجهر بحثا عن الاكتظاظ.

أولا ، استخدم معقما من الأسلاك البلاتينية عيار 30 معقما للحريق لنقل ما يقرب من عشر ديدان شابة متزامنة إلى ألواح NGM جديدة غير مصنفة. اترك الديدان دون إزعاج لمدة خمس دقائق للسماح لها بالوقت للتأقلم مع اللوحة الجديدة. ثم قم بتعقيم شعر الحاجب المتصل بنهاية سيخ خشبي أو عود أسنان عن طريق غمس 70٪ من الإيثانول.

امسحي بمنديل نظيف وخالي من النسالة وانتظري دقيقة واحدة حتى يتبخر الإيثانول. المس الدودة برفق على الرأس باستخدام شعر الحاجب. كرر اللمسات ، مع السماح بعشر ثوان بين اللمسات للسماح للدودة بالتعافي.

استمر في اللمس ، واترك فترات التحفيز لمدة عشر ثوان حتى لا تتحرك الدودة للخلف. سجل عدد اللمسات المطلوبة لحدوث هذا التعود. يعد السماح بفاصل زمني لمدة عشر ثوان بين اللمسات أمرا مهما لأن هذا يسمح للحيوان بوقت التعافي ويساعد في الحصول على فحوصات سلوك التعود المتسقة.

وضعت البالغة التي تعرضت جنينيا لميكرومولار واحد أو تركيز أعلى من BPAs بيضا أقل بكثير مقارنة بالتحكم الذي يمثله الخط الأفقي. تظهر البالغة المشتقة من الأجنة التي تعرضت لتركيزات BPA منخفضة تصل إلى 0.1 ميكرومولار عجزا غير ترابطي بناء على العدد المتزايد من اللمسات الأمامية المطلوبة لتعتادها. أثناء تحضير الأجنة للتعرض ل BPA ، من المهم اختيار صفيحة بها البالغين C.elegans الذين يتغذون جيدا مع بويضات ناضجة مرئية تحت مجهر التشريح من أجل الحصول على حجم عينة كاف.

تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم السموم البيئية لتقييم آثار السموم وغيرها من المركبات المسببة لاضطراب الغدد الصماء على السلوك وتصميم التجارب الميكانيكية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تعريض أجنة C.elegans في المرحلة المبكرة ل BPA وكيفية اختبار سلوك التعود في البالغين الناتجين المشتقة من الأجنة المعرضة ل BPA.