تصوير الكالسيوم اثنين-فوتون في Dendrites العصبية في الدماغ شرائح

الهدف العام من هذه التجربة هو دراسة ارتفاعات الكالسيوم في التشعبات العصبية استجابة لنماذج التحفيز المختلفة باستخدام تسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة في سوما العصبية بالتوازي مع تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون في التشعبات. يمكن استخدام هذه الطريقة لمراقبة إشارات الكالسيوم في المقصورات التغصنية الصغيرة ، مما يسمح بالمراقبة الدقيقة للعمليات التي تحدث في الفروع المتغصنة أثناء تكامل المدخلات المتشابكة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكن من ملاحظة أنماط إشارات الكالسيوم بدقة وخصوصية مكانية زمانية عالية.

ضع دماغ الفأر على طبق بتري يحتوي على سكروز ACSF البارد المؤكسج باستمرار. لتحضير شرائح الحصين من الدماغ المستخرج ، اترك الدماغ يبرد لمدة دقيقتين تقريبا. بعد ذلك ، ضع قطعة من ورق الترشيح على طبق بتري معبأ بالثلج ، وانقل الدماغ إلى ورق الترشيح.

ثم قم بتشريح الدماغ إلى نصفي الكرة الأرضية. قم بلصق نصفي الكرة الأرضية المقطعين على منصة تقسيم اهتزازية ، واغمرها في صينية التقسيم المليئة بالسكروز ACSF المؤكسج المثلج. بعد ذلك ، قم بتقسيم شرائح بسمك 300 ميكرومتر عند درجة مئوية واحدة باستخدام مبرد اهتزاز أو وضع الثلج حول صينية الاهتزاز.

باستخدام فرشاة الطلاء ، انقل الشرائح التي تحتوي على الحصين إلى حمام من استعادة ACSF المؤكسج المسخن إلى 37 درجة مئوية. في هذه الخطوة ، انقل شريحة الحصين إلى حمام بهدف مجهر ثنائي الفوتون بالمسح بالليزر. قم ببث الحمام باستمرار باستخدام ACSF المؤكسج العادي.

بعد ذلك ، استخدم الفحص المجهري للتداخل التفاضلي بالأشعة تحت الحمراء لتحديد موقع الخلية ذات الأهمية باستخدام حجمها وشكلها وموضعها. بعد ذلك، املأ ماصة محفزة بمحلول ACSF عادي يحتوي على الفلوروفور الأحمر. قم بخفضه أعلى الشريحة بحيث يكون الطرف في نفس منطقة الخلية محل الاهتمام.

بعد ذلك ، املأ ماصة التصحيح بمحلول التصحيح ، وقم بتثبيتها على مرحلة الرأس. ضعه فوق الشريحة بحيث يكون طرفه فوق الخلية محل الاهتمام مباشرة. بعد ذلك ، ضع حقنة في محبس ثلاثي الاتجاهات ، وقم بتوصيلها بماصة التصحيح من خلال أنبوب بلاستيكي.

بحقن ضغط إيجابي ثابت في ماصة الرقعة، واحتفظ بمحبس المحبس في موضعه القريب. بعد ذلك ، افتح وحدة برنامج التحكم في مكبر الصوت MultiClamp ، وقم بالتبديل إلى وضع مشبك الجهد بالنقر فوق الزر VC. افتح برنامج الحصول على بيانات الفيزيولوجيا الكهربية Clampex لتسجيل الإشارات الفيزيولوجية الكهربية ، وانقر فوق أيقونة اختبار الغشاء لإرسال نبضة جهد مربع ثابت لمراقبة التغيرات في مقاومة الماصة.

الآن ، اخفض ماصة التصحيح حتى تصبح أعلى الخلية المستهدفة مباشرة. عند ملامسة غشاء الخلية ، قم بإزالة الضغط عن طريق تحويل محبس التثبيت إلى الوضع المفتوح. بعد ذلك، قم بتطبيق ضغط سلبي طفيف على ماصة التصحيح باستخدام حقنة فارغة مثبتة في محبس التثبيت حتى تصل مقاومة الماصة إلى جيجا أوم واحد.

في نافذة اختبار الغشاء لبرنامج الحصول على البيانات ، قم بتثبيت الخلية عند سالب 60 مللي فولت. استمر في الضغط السلبي حتى تنخفض مقاومة الماصة ويتحقق تكوين الخلية بأكملها. في وحدة برنامج التحكم في مكبر الصوت MultiClamp ، اضبط تكوين التصحيح على المشبك الحالي بالنقر فوق الزر IC ، وسجل خصائص الغشاء استجابة للحقن الجسدي للتيارات المفرطة الاستقطاب وإزالة الاستقطاب.

انتظر لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى تمتلئ الخلية بالمؤشرات الموجودة في محلول التصحيح. للحصول على الصور ، حدد موقع التغصنات ذات الأهمية باستخدام إشارة التألق الأحمر. تأكد من استجابة مرئية عن طريق اختيار تغصنات قريبة أقصر من 50 ميكرومتر ، حيث قد تنخفض كفاءة الانتشار الخلفي AP بشكل كبير مع المسافة في الخلايا العصبية الداخلية GABAergic ، والتبديل إلى وضع xt.

باستخدام وحدات التحكم في شدة الليزر ، اضبط ليزر الفوتون الثنائي على مستوى طاقة ضئيل حيث يكون التألق الأخضر الأساسي مرئيا قليلا ، لتجنب السمية الضوئية. بعد ذلك ، في نافذة بروتوكول برنامج الحصول على بيانات الفيزيولوجيا الكهربية Clampex وبرنامج الحصول على الصور ، قم بإنشاء تجربة تسجيل للمدة المطلوبة تحتوي على حقن تيار جسدي للسعة المطلوبة. بعد ذلك ، انقر فوق بدء التسجيل زر ، واحصل على التألق بشكل مستمر لمدة ثانية إلى ثانيتين.

كرر الحصول على الصورة من ثلاث إلى 10 مرات. انتظر 30 ثانية على الأقل بين عمليات الفحص الفردية لتجنب تلف الضوء. لتسجيل عابرات الكالسيوم الشجيرية الناجمة عن التحفيز الكهربائي ، حدد موقع التغصنات ذات الأهمية باستخدام إشارة التألق الأحمر.

ضع الماصة المحفزة على سطح الشريحة فوق التغصنات المعنية. اخفض ماصة التحفيز ببطء من 10 إلى 15 ميكرومتر من التغصن، مما يقلل من الحركة لتجنب إزعاج تكوين الخلية بأكملها. لتصور موقع النطاقات الدقيقة المشبكية في الخلايا العصبية الشوكية ، في برنامج الحصول على الصور ، قم بالتبديل إلى وضع xt ووضع الخط على طول الفرع الشجيري محل الاهتمام.

في نافذة البروتوكول، قم بإنشاء نسخة تجريبية للتسجيل تؤدي إلى التحفيز. باستخدام برنامج الاستحواذ ، قم بالمسح الضوئي على طول التغصنات بشكل مستمر لمدة ثانية إلى ثانيتين. كرر الاستحواذ ثلاث إلى خمس مرات ، مع الانتظار 30 ثانية بين عمليات الفحص لمنع تلف الضوء.

للحصول على معلومات أولية عن مورفولوجيا الخلية والاحتفاظ بسجل لموقع ماصة التحفيز ، احصل على مكدس Z للخلية في القناة الحمراء. باستخدام برنامج الاستحواذ في وضع xyz ، قم بتعيين حدود المكدس العلوية والسفلية لتصوير الخلية بأكملها مع تضمين جميع العمليات. بعد ذلك ، قم بتعيين حجم الخطوة عند ميكرومتر واحد ، وابدأ اكتساب المكدس باستخدام زر بدء التسجيل.

عند اكتمال اكتساب Z-stack، استخدم خيار الحد الأقصى للإسقاط في البرنامج لتركيب جميع الخطط البؤرية للمكدس والتحقق من جودة الاستحواذ. ثم اسحب ماصة التصحيح ببطء من الشريحة. لإصلاح الشريحة لتحديد المورفولوجية اللاحقة ، قم بإزالة الشريحة بسرعة من الحمام باستخدام فرشاة طلاء ، وضعها بين ورقتي ترشيح في طبق بتري مملوء ب ACSF.

استبدل ACSF بمحلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ ، واترك الطبق في أربع درجات مئوية طوال الليل. في هذا الشكل ، يظهر الحد الأقصى للإسقاط لمكدس Z ثنائي الفوتون خلقا عصبيا داخليا مصحعا مملوءا ب Alexa-594. تشير رؤوس الأسهم البيضاء إلى موقع الأطراف المحورية داخل الطبقة الهرمية ، مما يشير إلى أن الخلايا العصبية الداخلية عبارة عن خلية سلة.

يوضح هذا الشكل الفرع الشجيري الذي تم وضع القطب الكهربائي المحفز بالقرب منه. يعرض الخط المتقطع موقع مسح الخط. توضح الصور هنا نتيجة مسح الخط في القناتين الحمراء والخضراء.

يشير ارتفاع التألق الأخضر في وقت التحفيز إلى ارتفاع تركيز الكالسيوم في تلك المنطقة. يمكن تجميع الصور في أجزاء أصغر ، مما يسمح بتحليل انتشار الاستجابة. تظهر الآثار التي تظهر هنا عابرات الكالسيوم المستمدة في أجزاء مختلفة استجابة للتحفيز الكهربائي المسجل على المستوى الجسدي أثناء تجربة التصوير.

ينخفض سعة عابرة الكالسيوم مع المسافة من النقطة الساخنة المركزية ، مما يشير إلى أن الاستجابة موضعية مكانيا. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تصوير الصبغة الحساسة للجهد أو علم البصريات الوراثي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل التغييرات المحلية في إمكانات الذاكرة داخل الفروع المتغصنة أو تكامل مدخلات محددة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مراقبة تقلبات الكالسيوم المعتمدة على النشاط في التشعبات العصبية باستخدام مجموعة من تقنيات الفيزيولوجيا البصرية ، والتي ستكون مفيدة لاستكشاف تعقيدات تكامل المدخلات المتغصنة واللدونة.