كشف حساسة للغاية وكمية من البروتينات وعلى إيسوفورمس بطريقة تركز Isoelectric الشعرية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البحوث الطبية الحيوية، مثل اكتشاف العلامات البيولوجية، واكتشاف الأدوية، والتشخيص، وفحص الأدوية أو الأجسام المضادة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها عالية الإنتاجية ويمكنها اكتشاف أشكال البروتين على نحو قابل للاستنساخ. الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد نحو تشخيص العديد من الأمراض لأنها يمكن أن تقيس البروتينات المتضررة أو isoforms.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة مسارات إشارات الخلية، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أنظمة أخرى حيث بروتينات محددة تحتاج إلى تحليل. المرئية مظاهرة من هذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية كما خطوات الفحص من الصعب تعلم بسبب الحيل، مثل إزالة فقاعات، تحميل لوحة، وهلم جرا. أولاً، إعداد مزيج diluent عينة عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من مزيج مثبطات DMSO واثنين من microliters من مثبطات البروتياز إلى 47 ميكرولترات من عينة diluent، بحيث التركيز النهائي من DMSO ومثبطات البروتياز هو واحد X.Dilute البروتين المعزول سابقا باستخدام مزيج diluent عينة للحصول على التركيزات المطلوبة.

المقبل, إضافة 3.325 ميكرولترات من سلم القياسية, ستة ميكرولتررس من مثبطات البروتياز, وثلاثة ميكرولترات من مثبطات DMSO إلى 137.675 ميكرولترات من قبل ميثوليت. دوامة العينة على الأقل 15 ثانية والحفاظ على الجليد. مزيج من اثنين من الحلول المعدة في نسبة واحد إلى ثلاثة بحيث تركيزات النهائي من مثبطات PROTEAS DMSO والسلالم القياسية نقطة isoelectric هي واحدة X والبروتينات في الشعيرات الدموية تصل إلى التركيزات النهائية المرجوة.

بعد إضافة البروتينات إلى خليط العينة، سيتم تنفيذ جميع الخطوات على الجليد أو عند أربع درجات مئوية. ضع لوحة 384-جيدا على الجليد. تحميل عشرة ميكرولترات من مزيج عينة في بئر المناسبة من لوحة، وفقا لتخطيط قالب المقايسة مصممة مع برنامج نظام النشاف الغربية الآلي.

بعد ذلك، تمييع الأجسام المضادة الأولية والثانوية مع ذوبان الأجسام المضادة. ثم، ماصة عشرة ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية و 15 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية في كل بئر. بعد ذلك، مزيج من اللمعان و بيروكسيد XDR في نسبة واحد إلى واحد.

الماصات 15 ميكرولترات من مزيج بيروكسيد لومينيل في كل بئر. وبمجرد إضافة العينات والريغان إلى اللوحة، فإن أجهزة الطرد المركزي لمدة عشر دقائق تبلغ 2500 مرة G وأربع درجات مئوية لتدور أسفل السائل وتزيل الفقاعات. إذا كانت الفقاعات لا تزال موجودة، إزالتها يدويا باستخدام طرف ماصة رقيقة.

افتح برنامج نظام النشاف الغربي الآلي وانقر فوق new'from the ملف القائمة. انتقل إلى جزء التخطيط وتعيين مواقع لـ reagants والعينات في لوحة 384-well. جعل مهمة reagant بالنقر فوق بئر في أي مكان في الكتلة.

حدد كتلة صف من 12 بئرًا لكل منها. بعد ذلك، انتقل إلى شريط الأدوات جزء تخطيط وإدراج كتلة صف أساسي أو ثانوي أو لومين. انتقل إلى جزء البروتوكول وحدد موقع reagant في اللوحة.

ثم انقر فوق الخلية في عمود العينة وحدد ريجانت من القائمة المنسدلة. وبنفس الطريقة، حدد مواقع الريغانت للأماكن الابتدائية والثانوية والمينفلة لكل دورة. انقر فوق الخلايا واحدة في كل مرة في عمود الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية وتغيير أوقات الحضانة إذا لزم الأمر.

ثم، إضافة دورات بالنقر فوق Add'button في المقطع البروتوكول. في جزء القالب، أدخل المعلومات المتعلقة بالعينة، مثل هوية الأجسام المضادة الأساسية والثانوية، وأرقام الكتالوجات الخاصة بها، و عمليات التخفيف. حفظ ملف الفحص الجديد.

قبل النقر على زر start'، تحقق من التخطيط بسرعة للتأكد من صحة كل شيء. الآن، انقر فوق start'لبدء التشغيل. البرنامج سوف يطالب المستخدم لإزالة النفايات، لإعادة ملء مربع الماء والشعيرات الدموية، لإضافة anolite والكاثوليت إلى علبة المورد، لإضافة العازلة غسل، وتحميل لوحة في علبة عينة المبردة.

سيتم عرض شريط حالة على شاشة الكمبيوتر بضع دقائق بعد بدء تشغيل. انقر على شاشة ملخص التشغيل لرؤية أجزاء الحالة والفصل. لمراقبة فصل الكهرباء في شعرية، تشغيل الفيلم فصل لهذا الشعرية عن طريق النقر على الدورة المطلوبة ومن ثم النقر على زر التشغيل في لوحة التحكم.

افتح ملف التشغيل وحدد علامة تبويب شاشة التحليل. انقر فوق edit'ثم analysis'لتغيير نطاق النقاط الأيزوئيكتريك. تطبيق معيار نقطة الأزوية المناسبة.

أضف نوبة ذروة، وأضف اسم الذروة. وأخيراً، حدد البيانات التي تريد استخدامها في علامة التبويب "الذروة" ثم قم بتصدير البيانات لمزيد من التحليل. يظهر هنا مخطط كهربي من الكنيات الشعاعية غير الخلوية الخاضعة للتنظيم من عوامل النمو البطانية الوعائية المحفزة.

هناك تحريض عالية جدا من البروتينات الفوسفورية لوحظت مع عامل النمو البطانية الوعائية. يظهر inset التحكم في التحميل الذاتية، HSP 70، مما يدل على تحميل مماثل للعينات لكل من العينات غير المعالجة والمعالجة. في النبع المناعي التقليدي ، تم اكتشاف نطاقين فقط ، على الرغم من أن بروتينات كيناز الإشارات غير الخلوية الخاضعة للتنظيم تم حلها إلى أربع قمم عن طريق تحليل التركيز الإيزوتري الشعري.

يظهر هنا مخطط كهربائي من kinases التي تنظمها الإشارة خارج الخلية من عامل النمو البطانية الوعائية المحفزة. يظهر inset نفس عنصر التحكم التحميل المستخدمة في نفس الوقت. يظهر النبل المناعي التقليدي شريطين فقط مطابقين لـ كيناز واحد منظم من خارج الخلية ومنظمه إشارة خارج الخلية.

في حين أنه مع التركيز على الأيزوتريك الشعري ، تم حل بروتينات كيناز غير الخلوية المنظمة للإشارات إلى ست قمم ، تقابل جميع القمم الأربع المختلفة ذات الفوسفور وقممين غير الفوسفورية. مرة واحدة يتقن، يمكن أن يتم هذا الأسلوب في غضون ساعات قليلة، اعتمادا على عدد الدورات، إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر لاستخدام تركيزات الأجسام المضادة أعلى بالمقارنة مع مناعة التقليدية.

العرض التوضيحي البصري لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية حيث أن خطوات الفحص يصعب تعلمها بسبب الحيل ، مثل إزالة الفقاعات ، تحميل اللوحة ، وما إلى ذلك. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم مقايسة، وإعداد العينات، وتشغيل الفحص، وتحليل البيانات لمراقبة isoforms مختلفة من البروتين الخاص بك.