القياس الكمي لبروتين اميلويد السلائف γ-سيكريتاسي-بوساطة والانقسام الشق في لوسيفراس يستند إلى الخلية مراسل منصات المقايسة

الهدف العام من هذا الاختبار الجيني المراسل الكمي القائم على الخلايا لغاما سيكريتيز هو فحص التأثير التفاضلي لمعدلات جاما سيكريتيز المفترضة على الانقسام بوساطة سكريتاز جاما. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال مرض الزهايمر ، مثل تحديد معدلات جاما سيكريتيز الجديدة لعلاج مرض الزهايمر. تتمثل ميزة هذه التقنية في أنها نظام فحص عالي الكفاءة ، ويمكنها بسهولة تحديد معدلات جاما سيكريتيز.

يمتد تأثير هذه التقنية إلى علاج مرض الزهايمر من خلال الاكتشاف المحتمل للأدوية المضادة لمرض الزهايمر مع الحد الأدنى من الآثار الجانبية. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لانتقائية الركيزة لسكريتاز جاما. كما يمكن تطبيقه على دراسات أمراض أخرى ، مثل الورم الأرومي العصبي.

قد يعاني الأفراد الجدد في هذه الطريقة من خلال الإزالة الدقيقة وإضافة وسائط زراعة الخلايا إلى 96 صفيحة دقيقة ، حيث قد يؤدي الكثير من الاضطراب إلى تعقيد النتائج النهائية. ابدأ هذا الإجراء بإعداد خلايا NG و CG ، كما هو مشار إليه في بروتوكول النص. عد خلايا NG أو CG باستخدام مقياس الدم.

بعد ذلك ، قم بزرع الخلايا في 20،000 خلية لكل بئر على صفيحة دقيقة مكونة من 96 بئرا بحجم نهائي قدره 200 ميكرولتر لكل بئر في وسط النمو. انقل الصفائح الدقيقة إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من وسط النمو من كل بئر.

أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من وسط النمو يحتوي على ميكروغرامين لكل مليلتر من التتراسيكلين إما مع 0.2٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، أو اثنين من ميكرومولار CL-387 ، أو 785 ، أو اثنين من ميكرومولار DAPT ، أو مثبطات ErbB1 / ErbB2 الأخرى ذات الصلة. احتضان الخلايا المعالجة والصفائح الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة ، قم بإزالة 150 ميكرولتر لكل بئر من وسط النمو من الصفائح الدقيقة.

ثم أضف 50 ميكرولتر لكل بئر من كاشف فحص لوسيفيراز. بعد ذلك ، انقل الصفائح الدقيقة إلى قارئ اللفائح الدقيقة ، واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. حدد التلألؤ المنبعث من لوسيفيراز اليراع باستخدام برنامج محدد مسبقا مخزن في قارئ اللفائح الدقيقة للتلألؤ.

أولا ، افتح برنامج التحكم في الأداة. ثم ، من قائمة الأدوات ، حدد قياس اللوء. ضمن إعداد المعلمات ، اختر لا يوجد عامل تصفية لمرشح الانبعاثات ، وحدد عادي لفتحة البث ، وأدخل واحدا لوقت العد ، وانقر فوق موافق لإعداد قراءة اللمعان.

ضمن علامة التبويب التحكم في الأداة ، قم بالتمرير عبر قائمة البروتوكولات النشطة ، وحدد البروتوكول المخزن مسبقا لقراءة اللمعان. ضمن علامة التبويب Live display، حدد المقياس من القائمة المنسدلة، وحدد Logarithm أو Linear للنوع. ضمن علامة التبويب درجة الحرارة، حدد إيقاف لتسخين اللوحة.

أخيرا ، انقر فوق ابدأ زر لإجراء قراءة التلألؤ. قم بتصدير النتائج إلى تنسيق جدول بيانات باستخدام المستكشف المضمن في برنامج التحكم. تقدير تلألؤ الخلفية من خلايا CG أو NG المعالجة بوسط نمو لا يحتوي على التتراسيكلين.

تحديد إشارة التلألؤ المنبعثة من خلايا CG أو NG المعالجة بنسبة 0.1٪ DMSO في وسط النمو الذي يحتوي على ميكروغرام واحد لكل مليلتر من التتراسيكلين وحده كنشاط نسبي 100٪ من سيكريتيز جاما. أخيرا ، قم بتطبيع إشارات لوسيفيراز من خلايا CG أو NG التي يتم زراعتها بوسط نمو يحتوي على التتراسيكلين وإما CL-387 أو 785 أو DAPT إلى إشارة لوسيفيراز المنبعثة من خلايا CG أو NG المعالجة ب DMSO. تظهر هنا ، نتائج تمثيلية توضح القياسات الكمية لانقسام جاما سيكريتاز APP-C99 في خلايا CG.

عولجت الخلايا بميكرومولار واحد من CL-387 أو 785 أو DAPT في وجود ميكروغرام واحد لكل مليلتر من التتراسيكلين عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تم قياس التلألؤ المشتق من التحلل البروتيني بوساطة جاما سيكريتيز ل C99-GV بعد إضافة 100 ميكرولتر لكل بئر من كاشف فحص لوسيفيراز. تم تعيين إشارة لوسيفيراز المنبعثة من الخلايا المعالجة بالمركبة وحدها على أنها تلألؤ نسبي بنسبة 100٪.

تظهر هنا النتائج التمثيلية التي توضح القياسات الكمية لانقسام جاما سيكريتيز N-delta-E في خلايا NG. وبالمثل ، عولجت الخلايا بميكرومولار واحد من CL-387 أو 785 أو DAPT في وجود ميكروغرام واحد لكل مليلتر من التتراسيكلين عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تم قياس التلألؤ المشتق من الانحلال البروتيني بوساطة جاما سيكريتيز ل N-delta-E-GV بعد إضافة 100 ميكرولتر لكل بئر من كاشف فحص لوسيفيراز.

تم تعيين إشارة لوسيفيراز المنبعثة من الخلايا المعالجة بالمركبة وحدها على أنها تلألؤ نسبي بنسبة 100٪. بمجرد إتقانها ، لا تتطلب هذه التقنية سوى وقت عملي من ساعة إلى ساعتين ، في انتظار عدد المركبات المراد فحصها. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحث في مجال مرض الزهايمر لاستكشاف المعدل الجيني والكيميائي لغاما سيكريتيز سعيا وراء علاجات جديدة لمرض الزهايمر.