استخدام Fluorescence في الموقع التهجين (الأسماك) لرصد حالة التماسك الذراع في بروميتافاسي والطوريه وأنا بويضات المورفولوجية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مجسات FISH وتصور حالة تماسك الذراع الانتصافي في بويضات ذبابة الفاكهة أثناء الطور الأول والطور الأول. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للمرء بفحص حالة تماسك الذراع في الطور الأولي والطور الأول ، وبويضات ذبابة الفاكهة المعتقلة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال ذبابة الفاكهة الانقسام الاختزالي مثل ما هي الظروف التي تؤدي إلى فقدان تماسك الذراع قبل الأوان؟

هذه التقنية لديها القدرة على توسيع فهمنا لتأثير عمر الأم في البشر والذي يحدث ، على الأقل جزئيا ، لأن التماسك الانتصافي يتدهور مع تقدم البويضات في العمر. ابدأ هذا البروتوكول بإنشاء مسبار الذراع ل FISH ، بالإضافة إلى تشريح البويضات وتثبيتها كما هو مفصل في بروتوكول النص. لفصل البويضات في المرحلة المتأخرة ، أضف أولا ملليلترا واحدا من PBSBTX إلى طبق تشريح ضحل.

بعد ذلك ، استخدم P-200 بطرف مطلي ب BSA لنقل المبايض الثابتة إلى الطبق الضحل. قم بتمرير المبايض لأعلى ولأسفل باستخدام طرف الماصة المطلي ب BSA لإخراج البويضات الناضجة من البويضات الأقل نضجا. عندما يتم فصل البويضات في المرحلة المتأخرة بشكل كاف ، انقل كل الأنسجة إلى أنبوب ميكرو بوزن 500 ملليلتر.

قم بإزالة السائل الزائد باستخدام ماصة باستور المسحوبة مع ترك حوالي 150 إلى 200 ميكرولتر في الأنبوب. للتحضير لدرفلة البويضات ، قم بترطيب طبق بئر عميق مسبقا مع 200 ميكرولتر من PBSBTX. غطي الطبق واتركيه جانبا.

احصل على ثلاث شرائح زجاجية بلورية ، واترك الشريحة ثلاث جانبا. بعد ذلك ، افركي المناطق الزجاجية المصقولة برفق من الشرائح واحدة واثنتين معا. اشطفها بالماء منزوع الأيونات لإزالة أي شظايا زجاجية وجففها بمنديل يمكن التخلص منه.

قم بتغطية المناطق المتجمدة من الشريحتين الأولى والثانية ب PBSBTX عن طريق إضافة 50 ميكرولترا من PBSBTX إلى شريحة واحدة وفرك هذه المنطقة بالشريحة الأخرى. قم بإزالة السائل بمنديل يمكن التخلص منه ، وضع الشرائح تحت مجهر تشريح. حافظ على ملامسة المناطق المتجمدة من الشريحتين الأول والثاني، مع دعم الشريحة الثالثة للشريحة الثانية.

لدحرجة البويضات ، قم أولا بترطيب طرف ماصة P-200 مسبقا في PBSBTX وتفريق البويضات في أنبوب الطرد الدقيق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. انقل 50 ميكرولترا من السائل الذي يحتوي على البويضات إلى وسط الجزء الزجاجي المصنفر من الشريحة الأولى. ارفع الشريحة الثانية للقيام بذلك.

قم بخفض الشريحة الثانية ببطء حتى يخلق التوتر السطحي للسائل ختما بين منطقتي الزجاج المصنفر. يجب أن يكون هناك سائل كاف لتغطية المنطقة المتجمدة ، ولكن لا ينبغي أن يتسرب أي منها. بعد ذلك ، أمسك الشريحة السفلية في مكانها بيد واحدة ، واستخدم اليد الأخرى لتحريك الشريحة العلوية اثنين للخلف وللأمام في اتجاه أفقي مع الحفاظ على الشريحة في مستويين ومدعومة في الشريحة الثالثة.

قم بالأداء تحت المجهر لسهولة تصور حركات البويضات وتقدمها. بعد بضع حركات في الاتجاه الأفقي ، قم بتغيير زاوية الحركة قليلا. بزيادات متعددة ، قم بزيادة هذه الزاوية تدريجيا إلى 90 درجة حتى تصبح حركة الشريحة العلوية الثانية عمودية على اتجاه البداية.

لاحظ أن المشيمات الفارغة ستكون مرئية في السائل وأن البويضات التي تفتقر إلى المشيمات ستظهر أطول وأرق. عند دحرجة البويضات ، تأكد من أن اتجاه التدحرج دائما في خط مستقيم وليس حركة دائرية أبدا. كرر التدحرج حوالي سبع إلى 10 مرات حتى يصبح المحلول غائما قليلا.

توقف عن التدحرج عندما يبدو أن غالبية البويضات قد فقدت أغشية الزجاج. ارفع الشريحة العلوية برفق ، واسحب إحدى أركانها إلى وسط المنطقة المتجمدة من الشريحة السفلية ، بحيث تتراكم البويضات الملفوفة في وسط المنطقة المصقولة. اشطف البويضات من كلتا الشريحتين باستخدام PBSBTX في طبق البئر العميق الذي يحتوي على PBSBTX.

نظف الشرائح الأولى والثانية بالماء عالي النقاء. يجف بمنديل يمكن التخلص منه وإعادة ضبطه. كرر هذه الخطوات حتى يتم لف جميع البويضات من نفس النمط الجيني.

يتطلب هذا عادة ثلاث إلى أربع جولات من التدحرج لكل نمط جيني. لإزالة الحطام بعد الدرفلة ، أضف ملليلتر واحد من PBSBTX إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. حرك السائل لتغطية جوانب الأنبوب.

باستخدام طرف ماصة P-1 ، 000 مطلي ب PBSBTX ، انقل البويضات الملفوفة من طبق البئر العميق إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على مليلتر واحد من PBSBTX. أضف ملليلترين إضافيين من PBSBTX إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على البويضات. أمسك الأنبوب المخروطي على خلفية داكنة لرؤية البويضات غير الشفافة أثناء غرقها.

بعد ترك البويضات تستقر في القاع ، استخدم P-1 ، 000 لإزالة المليلترين العلويين من المحلول الذي يحتوي على الحطام والتخلص منه. بعد تكرار الخطوة لما مجموعه ثلاث جولات من إزالة الحطام ، استخدم طرف ماصة P-1 ، 000 مطلي ب PBSBTX لنقل البويضات مرة أخرى إلى أنبوب الطرد الدقيق الأصلي سعة 500 ميكرولتر. يجب أن تنتج 20 إلى 25 أنثى ما يقرب من 50 ميكرولترا من البويضات الناضجة المدرفلة.

كرر هذه العملية للأنماط الجينية المتبقية باستخدام شرائح بلورية طازجة وطبق نظيف عميق وأنبوب مخروطي جديد لكل نمط وراثي. اشطف البويضات ب 500 ميكرولتر من PBS تحتوي على 1٪ Triton X-100. قم بإزالة السائل وأضف 500 ميكرولتر من مخزن الاستخلاص

احتضان العينة على المغذي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد إجراء عمليات الغسيل قبل التهجين كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بإجراء التمسخ والتهجين. أولا، استخدم طرف ماصة P-200 المطلي ب BSA لنقل البويضات إلى أنبوب PCR سعة 200 ميكرولتر.

احتفظ بالعينات عند 37 درجة مئوية واترك البويضات تستقر في القاع. من المهم التحلي بالصبر عند تغيير المحاليل حتى لا تضيع البويضات في هذه العملية. بمجرد أن تستقر البويضات ، استخدم ماصة باستور المسحوبة لإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل.

ثم أضف 40 ميكرولترا من محلول التهجين المحتوي على المسبار إلى البويضات. ضع أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي على البويضات في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل واحتضنه كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد إضافة المسبار إلى البويضات ، احتفظ بها في الظلام قدر الإمكان.

لغسل ما بعد التهجين ، قم بتسخين 2X SSCT بالإضافة إلى 50٪ فورماميد إلى 37 درجة مئوية واحتفظ به في حاضنة التهجين. باستخدام طرف ماصة P-200 المطلي ب BSA، أضف 100 ميكرولتر من 37 درجة مئوية 2X SSCT بالإضافة إلى 50٪ فورماميد إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل مع البويضات، وانقل البويضات إلى أنبوب ميكرو فوج جديد سعة 500 ميكرولتر. بعد إضافة 400 ميكرولتر إضافي من 37 درجة مئوية 2X SSCT بالإضافة إلى 50٪ فورماميد إلى نفس الأنبوب ، اترك البويضات تستقر عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.

غالبا ما يستغرق الاستقرار وقتا أطول في هذه الخطوة. ليس من غير المعتاد أن تستغرق 15 دقيقة أو أكثر. سيؤدي قلة الصبر إلى فقدان كبير للبويضات.

بعد السماح للبويضات بالاستقرار ، قم بإزالة السائل باستخدام ماصة باستور المسحوبة. أضف 500 ميكرولتر من 37 درجة مئوية 2X SSCT بالإضافة إلى 50٪ فورماميد عند 37 درجة مئوية واغسل البويضات بالدوران. بعد كل خطوة دوران مائلة للغسيل ، احتفظ بالبويضات عند 37 درجة مئوية أثناء استقرارها.

بعد غسلات إضافية في درجة حرارة الغرفة ، قم بتلطيخ البويضات باستخدام DAPI عن طريق غسل البويضات لمدة 20 دقيقة في 500 ميكرولتر من محلول DAPI بمقدار ميكروغرام واحد لكل مليلتر في 2X SSCT على المغذية. بعد شطف البويضات ثلاث مرات في 500 ميكرولتر من 2X SSCT ، اغسل البويضات مرتين لمدة 10 دقائق لكل منها في 500 ميكرولتر من 2X SSCT على المغذيات. يمكن تخزين العينات لمدة تصل إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة في الظلام حتى تصبح جاهزة للتركيب على زلات الغطاء.

مع طرف ماصة P-200 المطلي ب BSA، قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل لتفريق البويضات في جميع أنحاء المحلول. بعد ذلك ، انقل 40 ميكرولترا من محلول البويضة إلى زلة غطاء مطلية ب poly-L-lysine. قم بإزالة بعض السائل من زلة الغطاء باستخدام ماصة باستور المسحوبة حتى تلتصق البويضات بزلة الغطاء ولكنها لا تزال محاطة بالسائل.

باستخدام الملقط ، اضغط باستمرار على زلة الغطاء على جانب واحد ، واستخدم إبرة التنغستن لفصل كتل البويضات برفق لتحريكها لتحقيق طبقة واحدة من البويضات غير المتداخلة. قم بإزالة ما تبقى من السائل حول البويضات باستخدام ماصة باستور المسحوبة. بعد ذلك، قم بخفض الشريحة ببطء باتجاه زلة الغطاء بحيث تواجه وسائط التثبيت العينة حتى تلامس الوسائط العينة.

بعد ترك الشرائح تجف لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام في الظلام ، احصل على صور متحدة البؤر للمسح الضوئي بالليزر باستخدام فتحة عدمية عالية 40 مرة من هدف الزيت مع تكبير رقمي ست مرات كما هو مفصل في بروتوكول النص. من الضروري وجود حزمة برامج تسمح للمرء بعرض الصور وتسجيل عيوب التماسك في ثلاثة أبعاد. يسمح ذلك للمرء بالتمرير عبر سلسلة Z لعرض نقاط FISH وحساب عدد إشارات الذراع الفردية بدقة.

تظهر إسقاطات الكثافة القصوى لسلسلة Z متحدة البؤر للبويضات ذات تماسك الذراع السليم والمتعطل. في هذه الأشكال ، تكون إشارة مسبار الذراع صفراء وإشارة المسبار حول المركز حمراء. تشير بقعتان لمسبار الذراع إلى أن الكروماتيدات الشقيقة معا وأن تماسك الذراع سليم.

تشير ثلاث بقع مسبار للذراع إلى أن زوجا واحدا من الكروماتيدات الشقيقة قد فقد تماسك الذراع قبل الأوان بينما لم يفقد الزوج الآخر من الأخوات. إذا تم توصيل نقطتين مسبار الذراع بخيط ، فلن يتم تسجيل الكروماتيدات الشقيقة على أنها منفصلة. لذلك ، يعتبر الشكل الانتصافي مثل هذا يحتوي على ثلاث نقاط مسبار للذراع فقط مع زوج واحد من الأخوات يظهران فقدانا مبكرا لتماسك الذراع.

الفقدان المبكر لتماسك الذراع لكلتا المجموعتين من الكروماتيدات الشقيقة إلى أربع نقاط مسبار للذراع. في جميع الأمثلة الأربعة الموضحة ، يكون التماسك المركزي سليما. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء دحرجة البويضات لنمط وراثي واحد في حوالي 25 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دحرجة البويضات ، وإجراء FISH باستخدام مجسات الذراع وتسجيل الصور لتحديد حالة تماسك الذراع الانتصافي في ذبابة الفاكهة البويضات. أثناء إجراء التهجين والغسيل ، من المهم أن تتذكر التحلي بالصبر. سيؤدي عدم الانتظار لفترة كافية حتى تستقر البويضات بعد كل خطوة غسيل إلى تقليل إنتاج البويضات للتصوير في النهاية.

قد يكون من الممكن تحسين هذا البروتوكول للجمع بين FISH والتلوين الأميني من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول توطين البروتين أو بنية المغزل الانتصافي مع مراقبة حالة تماسك الذراع أيضا. سيمهد تطوير هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال ذبابة الفاكهة الانقسام الاختزالي لاستكشاف الآليات التي تضمن وتعطل تماسك الذراع الانتصافي وتأثير فصل الكروموسومات.