على نطاق الجينوم الكمي للترجمة في مهدها الخميرة بالتنميط الريبوسوم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد مناطق mRNA التي تترجم إلى بروتينات تقيس ترجمة البروتين كميا في الخميرة الناشئة saccharomyces cerevisiae على مستوى الجينوم. يمكن استخدام توصيف الريبوسوم لمراقبة معدل البروتينات والأمراض ودراسة آليات التنظيم الانتقالي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تضيف حساسية أكبر بكثير مقارنة بالطرق الأخرى ، ومن بينها ، قياس البروتينات والأمراض في الجسم الحي بدقة اتصال واحد.

على الرغم من أن هذا البروتوكول خاص بالخميرة الناشئة ، إلا أنه مفيد أيضا للباحثين الذين يحاولون إنشاء تنميط الريبوسوم في أنظمة نموذجية أخرى ، مثل خلايا وأنسجة الثدييات. سيتم تحضير المستخلصات من خلايا الخميرة المزروعة حتى منتصف مرحلة السجل. استخدم مجموعة مرشح حامل زجاجي لتصفية الثقافة من خلال مرشحات غشاء دقيق 0.45.

اكشطي الحبيبات بالملعقة ، وقم بتجميد الفلاش في النيتروجين السائل ، واحفظيها على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. ضع ثلاث حبات من الصلب الكروم 3.2 ملم في أنبوب من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة 1.8 مليلتر وقم بتبريد الأنبوب مسبقا في النيتروجين السائل. أضف الكريات المجمدة وقم بتغطية الأنبوب الفولاذي بغطاء مطاطي سيليكون.

قم بتجانس العينة عن طريق الطحن بالتبريد لمدة 10 ثوان عند 4200 دورة في الدقيقة. للحفاظ على العينات المجمدة أثناء عملية الطحن بأكملها ، من الأهمية بمكان تبريد الأنبوب في النيتروجين السائل لمدة 10 ثوان على الأقل بين كل طحن. عند الانتهاء من التجانس ، أضف ملليلترا واحدا من محلول التحلل الذي يحتوي على سيكلوهيكسيميد إلى العينة.

تخلط جيدا عن طريق سحب العينة وتنقل العينة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر. جهاز الطرد المركزي عند 20 ، 000 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر.

انقل 100 ميكرولتر من المحللة إلى أنبوب جديد آخر سعة 1.5 مليلتر لعزل بولي (أ) mRNA. قم بتجميد الأنابيب بعينات mRNA على بقية المحللة ، والتي سيتم استخدامها لاستخراج البصمة في النيتروجين السائل ، وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. في الليلة التي سبقت استخراج البصمة ، قم بإذابة الجليد بتدرجات السكروز المعدة مسبقا عند أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي ، قم بإذابة خلية التحلل على الجليد. انقل كمية من محللات الخلية التي تحتوي على 50 وحدة OD260 إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر ، وأضف مخزن مؤقت للتحلل الجديد يصل إلى مليلتر واحد و 10 ميكرولتر من RNase واحد. احتضن في درجة حرارة الغرفة مع دوران لطيف على محور دوار فوق الكعب لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، ضع طبقة برفق من عينة المحللة فوق تدرج السكروز بنسبة 10٪ إلى 50٪ في أنابيب البوليمر. باستخدام دوار SW41 ti ، جهاز طرد مركزي فائق عند 35،000 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات. أثناء الطرد الفائق ، قم بإعداد نظام تجزئة التدرج.

قم بتشغيل المكونات واترك شاشة الأشعة فوق البنفسجية تسخن لمدة 30 دقيقة على الأقل. املأ المحقنة بمحلول المطاردة وقم بإزالة أي فقاعات هواء داخل المحقنة والكانولا. عند اكتمال الطرد المركزي الفائق ، قم بتثبيت وثقب أنبوب الطرد المركزي الفائق الذي يحتوي على تدرج السكروز.

ابدأ مضخة الحقنة بمعدل واحد مليلتر في الدقيقة واجمع كسور مليلتر واحدة أثناء مراقبة قيم A254. يتم جمع الكسور التي تمثل ذروة ADS الأحادية وتجميعها. قم بتصفية الكسور من خلال مرشحات الطرد المركزي سعة 0.5 ملليلتر عند 12،000 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، وتخلص من التدفق ، وكرر ذلك حتى يصبح الحجم أقل من 100 ميكرولتر.

عند 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحرير الممزوج بسحب العينة واحتضانه على الجليد لمدة 10 دقائق ، انقل الوحدة إلى أنبوب تجميع جديد وجهاز طرد مركزي عند 12،000 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. اجمع التدفق. بعد ذلك ، قم بتنقية شظايا البصمة وترسيب العينات باستخدام ترسيب الإيثانول كما هو موضح في بروتوكول النص.

لبدء هذا الإجراء ، قم بالطرد المركزي للبصمة المترسبة وعينات mRNA المجزأة عند 20،000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد إزالة الإيثانول وتجفيف الكريات بالهواء ، نقوم بتعليق كل حبيبات في 7.75 ميكرولتر من الماء. إلى كل بيليه ، أضف ميكرولتر واحد من 10XT4 عازلة كيناز عديد النوكليوتيدات ، وميكرولتر واحد من كيناز بولي النوكليوتيدات T4 ، و 0.25 ميكرولتر من مثبط RNase.

احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. أضف 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت لعينة اليوريا 2X TBE إلى 10 ميكرولتر من كل بصمة وعينة mRNA. احتضان العينات وأدوات التحكم المناسبة عند 75 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق ، ثم قم بالدوران ، ثم ضعها على الثلج لمدة دقيقة واحدة.

قم بتحميل كل عينة في بئرين من هلام اليوريا TBE بنسبة 15٪ وافصل شظايا الحمض النووي الريبي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام عند 180 فولت لمدة ساعة واحدة. تلطخ الجل بصبغة هلام الحمض النووي ، محمية من الضوء لمدة خمس دقائق. أثناء تصور الجل تحت مصباح الضوء الأزرق ، قم باستئصال النطاق المناسب بين 28 و 32 نيوكليوتيد لعينات البصمة وحوالي 50 إلى 70 نيوكليوتيد لعينات الرنا المرسال.

قم بتجميد قطع هلام بولي أكريلاميد المستأصلة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 10 دقائق على الأقل قبل استخراج الحمض النووي الريبي من هلام بولي أكريلاميد. قبل النسخ العكسي ، قم بإجراء ثلاثة ربط للمحول الرئيسي وقم بتسريع العينات كما هو موضح في بروتوكول النص. أعد تعليق كل حبيبات في 11.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.

ثم أضف 0.5 ميكرولتر من ثمانية ميكرومولار التمهيدي للنسخ العكسي وميكرولتر واحد من مزيج dNTP. احتضن عند 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ثم ضعه على الثلج. أضف إلى كل عينة أربعة ميكرولترات من 5x المخزن المؤقت الأول ، وميكرولترين من 0.1 مولار DTT ، و 0.5 ميكرولتر من مثبط RNase ، و 0.5 ميكرولتر من النسخ العكسي.

احتضن عند 48 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، و 65 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، و 80 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. انتقل على الفور إلى التحلل المائي للحمض النووي الريبي عن طريق إضافة 0.8 ميكرولتر من اثنين من هيدروكسيد الصوديوم المولي إلى كل عينة واحتضانها عند 98 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أضف 0.8 ميكرولتر من كلوريد الهيدروجين المولي لتحييد التفاعل.

بعد ترسيب العينات كما هو موضح في بروتوكول النص ، أعد تعليق كل حبيبات في خمسة ميكرولترات من الماء الخالي من النوكلياز وأضف خمسة ميكرولترات من 2x TBE لعينة اليوريا. احتضن عند 75 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق ، ثم قم بالدوران ، والثلج لمدة دقيقة واحدة. قم بتحميل العينة في بئر واحد من هلام اليوريا 10٪ TBE.

افصل نواتج تفاعل النسخ العكسي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام 180 فولت لمدة 50 دقيقة. لطخ الجل ببقعة هلام الحمض النووي المحمية من الضوء لمدة خمس دقائق. باستخدام مصباح الضوء الأزرق ، قم باستئصال النطاق حول 128 نيوكليوتيد وأعلى.

قم بتجميد قطع هلام بولي أكريلاميد عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 10 دقائق على الأقل قبل استخراج الحمض النووي من هلام بولي أكريلاميد. لتعميم الحمض النووي ، أعد تعليق كل حبيبات DNA في 16.75 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. أضف ميكرولترين من 10x DNA lygase buffer أحادي الشريطة ، وميكرولتر واحد من 50 مللي مولر كلوريد المنغنيز ، و 0.25 ميكرولتر من DNA Ligase أحادي الشريطة.

احتضان عند 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، متبوعة ب 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بدون ترسيب ، قم بتخزين منتج تفاعل ربط الحمض النووي أحادي الشريطة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، قم بتضخيم مكتبة PCR متبوعا بقياس المكتبة وتسلسل الإنتاجية العالي كما هو موضح في بروتوكول النص.

يتم عرض ملفات تعريف المحلل الحيوي التمثيلي لمكتبة البصمة المضخمة PCR ومكتبة التسلسل التي تم الحصول عليها لعينات mRNA. يتراوح متوسط الحجم المتوقع لمكتبة البصمة من 148 إلى 152 نيوكليوتيد، والحجم المتوقع لمكتبة الرنا المرسال هو 170 إلى 190 نيوكليوتيد. يوضح هذا الرسم البياني العدد المجمع لقراءات mRNA والبصمة و rRNA التي تم الحصول عليها لتكرارين بيولوجيين مستقلين لعينة من النوع البري وطفرة حذف hbs1.

50٪ إلى 60٪ من جميع القراءات المتسلسلة في مكتبات البصمة تتوافق مع شظايا البصمة المحمية بالريبوسوم. في المقابل ، لوحظ 3٪ فقط من شظايا الحمض النووي الريبي المرسال في مكتبات الرنا المرسال ، مما يدل على أن عزل poly (A) mRNA يسمح بالقضاء الفعال على قراءات الحمض النووي الريبي. تظهر كل من مكتبات عينات البصمة والحمض النووي الريبي المرسال قابلية استنساخ جيدة كما هو موضح في معامل ارتباط بيرسون البالغ حوالي 0.99 بين العينات المتطابقة.

عند دمجها مع قياسات وفرة الرنا المرسال ، يسمح توصيف الريبوسوم بقياس التغيرات في كفاءة الترجمة بين الظروف التجريبية. يتم تجميع الجينات التي يتم تنظيمها بشكل كبير وذات تنظيم منخفض في طفرة حذف hbs1 وفقا لما إذا كانت تتأثر بتغيير في نسخ mRNA أو كفاءة الترجمة أو بتأثير شائع. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ البروتوكول بأكمله في حوالي 11 يوما.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ارتداء القفازات وتنفيذ جميع الخطوات باستخدام الكواشف والمواد الاستهلاكية الخالية من RNase لتجنب تلوث RNase وتقليل مخاطر تدهور الحمض النووي الريبي في العينات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء آثار أقدام الريبوسوم باستخدام هضم النوكلياز ، وعزل مجمعات بصمة الريبوسوم السليمة عن طريق تجزئة تدرج السكروز ، وإعداد مكتبات الحمض النووي للتسلسل العميق. لا تنس أن العمل باستخدام النيتروجين السائل يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء نظارات السلامة والقفازات المبردة أثناء التعامل مع المواد شديدة البرودة.