الفنية تصوير المصانع النسخ الفيروسية باستخدام مجهر الأسفار 3D

الهدف العام من الجمع بين الحمض النووي الريبي الناشئ والصعيدين الأميني للبروتينات الفيروسية الكامنة هو تصور النسخ النشط المقترن بتكوين مصنع النسخ الفيروسي. يمكن استخدام هذه الطريقة للمساعدة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علم الوراثة وبيولوجيا الخلية وعلم الفيروسات وعلم فيروسات بيولوجيا الخلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم نموذجا صغيرا للكروموسوم الفيروسي المحفز لدراسة التفاصيل الجزيئية وراء التعديلات المعمارية الجينية.

اجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي للخلايا لمدة دقيقتين عند جاذبية 200 فولت. اغسل الخلايا ثلاث مرات بمليلتر واحد من DEPC PBS المعقم.

بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في 1.2 مل من DEPC PBS. ضع الغطاء في قيعان صفيحة من ستة آبار. ماصة 200 ميكرولتر من خليط الخلية DEPC PBS على كل زلة غطاء.

بعد أن تستقر الخلايا لمدة دقيقتين ، استنشق DEPC PBS الزائد ، ولم يتبق سوى طبقة رقيقة من الخلايا. أضف بعناية ملليلتر واحد من محلول التثبيت لكل زلة غطاء. اسمح للخلايا بالإصلاح لمدة 10 دقائق.

اغسل زلات الغطاء ثلاث مرات باستخدام DEPC PBS. بعد الغسيل ، أضف بعناية ملليلتر واحد من الجلايسين DEPC PBS إلى التركيز النهائي للجلايسين البالغ 100 مللي مولار لكل زلة غطاء. اسمح للخلايا بالتبريد لمدة خمس دقائق.

أضف 1.5 مل من DEPC PBS وضعه على شاكر لمدة خمس دقائق ، ورجه بقوة ولكن برفق في متناول اليد لمدة دقيقة واحدة. استنشق DEPC PBS الزائد واحرص على عدم تعطيل الخلايا. أضف بعناية ملليلترا واحدا من محلول النفاذية لكل زلة غطاء.

اسمح للخلايا بالتغلغل لمدة 15 دقيقة. أضف 1.5 مل من DEPC PBS. ضع الخلايا على شاكر لمدة خمس دقائق ، ورج بقوة ولكن برفق في متناول اليد لمدة دقيقة واحدة.

استنشق DEPC PBS الزائد واحرص على عدم تعطيل الخلايا. قم بتسمية شرائح المجهر ، وبلل منشفة ورقية ثم قم بتبطين قاع وعاء بلاستيكي قابل للغلق بالمنشفة. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول الجسم المضاد الأساسي واضرب الوصفة لكل زلة غطاء.

ضع 30 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة الأولية على كل شريحة مجهر مصنفة. تأكد من صحة تركيز الجسم المضاد الأساسي عن طريق الضغط على زاوية زلة الغطاء ونقرها برفق. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام زاوية الأنسجة لامتصاص الرطوبة الزائدة.

ثم ضع زلة الغطاء على شرائح المجهر المسمى ، مع الحرص على عدم إدخال الفقاعات. قم بتغطية الجزء الخارجي من الحاوية بغلاف بلاستيكي. انقل الحاوية إلى حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

أثناء الحضانة ، قم بإعداد الكواشف اللازمة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام DEPC PBS في طبق من ستة آبار لمدة خمس دقائق لكل منها. ثم اغسل الخلايا باستخدام محلول غسيل FISH ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها.

واحتفظ بقلة الغطاء في مخزن غسيل FISH حتى الجسم المضاد الثانوي ، تم تحضير خليط مسبار الإنترون. بعد ذلك ، قم بتنظيف الشرائح الزجاجية لحضانة الأجسام المضادة الأولية للتهجين بالماء والصابون. بعد أن تجف ، نظفها بالإيثانول وأنسجة المختبر.

ضع 40 ميكرولترا من الجسم المضاد الثانوي ومسبار إنترون FISH مع المحلول على كل شريحة زجاجية. ضع زلات الغطاء مع الخلايا على الشرائح بحيث يكون جانب الخلايا متجها لأسفل أعلى المخزن المؤقت. واحرص على عدم إدخال الفقاعات.

ضع الشرائح في وعاء بلاستيكي مع منشفة ورقية مبللة في الأسفل. لف الحاوية البلاستيكية في غلاف بلاستيكي أول ، ثم ورق الألمنيوم. واحتضان الحاوية مع الشرائح.

بعد الحضانة ، حرك زلة الغطاء بحذر من حافة الشريحة الزجاجية وضعها مرة أخرى في ألواح من ستة آبار ، متجهة لأعلى. اغسل الخلايا باستخدام محلول غسيل FISH ثلاث مرات في طبق من ستة آبار لمدة خمس دقائق لكل منها. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام SSC ذو الطين.

أضف DAPI بتركيز واحد إلى 1000 في SSC المزدوج واترك المحلول لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا مرتين باستخدام SSC ذو الطين. قم بتنظيف الشرائح الزجاجية المستخدمة في التهجين وأضف 10 ميكرولتر من محلول التركيب على الشرائح الزجاجية.

ضع زلات الغطاء ووجهها لأسفل على محلول التثبيت. باستخدام أنسجة المختبر ، قم بإزالة محلول التثبيت الزائد برفق ، مع الحرص على عدم سحق الخلايا. باستخدام طلاء الأظافر ، ضعي طبقة وافرة حول حافة زلات الغطاء واتركي الطلاء حتى يجف.

العينة جاهزة الآن للفحص المجهري الفلوري. تم تلطيخ خلايا BCBL-1 من أجل LANA و K-Rta RNA لفحص مكان نسخ الأيزومات الفيروسية بنشاط وعدم تجانس الاستجابة لفيروس الهربس المرتبط بساركوما كابوسي ، أو محفزات إعادة تنشيط KSHV. يعد تألق K-Rta المميز في المناطق التي تتطابق بشكل وثيق مع توزيع الأغطية الفيروسية دليلا على النسخ النشط الذي يحدث بالقرب من جينومات KSHV.

في نفس العينة ، يمكن ملاحظة الخلايا التي تظهر مضان K-Rta أضعف ومنتشر لا يتداخل بشكل كبير مع LANA ، مما يوضح التباين الكبير ودرجة الاستجابة لمحفزات إعادة التنشيط داخل مجموعة من الخلايا. بعد ذلك ، تم فحص فعالية تزامن الثايميدين من خلال تصور التعبير عن البروتين الفيروسي الذي أظهر بوضوح أن الخلايا المتزامنة تستجيب لمحفزات إعادة التنشيط أكثر من السكان غير المتزامنين. يمكن أن يخدم تلطيخ DAPI عدة وظائف ، يوضح هذا المثال بوضوح أن هناك ثلاث خلايا منفصلة بدلا من خلية واحدة.

الفحص المجهري ثلاثي الأبعاد جنبا إلى جنب مع هذه التقنية عن هياكل PII الشبيهة بالحلقة التي شوهدت مع جينومات KSHV المنتشرة على الأطراف. مع تطوره ، سيوفر الكروموسوم الفيروسي المصغر أدوات فريدة للباحثين لاستكشاف التنظيم الزمني الخاص للتعبير الجيني وانحدار نواة الخلية.