الأيضي رسم الخرائط ذات الصلة: سيتوتشيميستري كمية إنزيم وهيستوتشيميستري لتحديد نشاط ديهيدروجيناسيس في الخلايا والأنسجة

يوضح هذا الفيديو كيفية إجراء رسم الخرائط الأيضية. إجراء لقياس نشاط إنزيمات معينة تسمى نازعة الهيدروجين. تلتصق الخلايا بشريحة الفحص المجهري أو الأنسجة المجمدة.

منذ عقود ، قمنا بتطوير سلسلة كاملة من تقنيات رسم الخرائط الأيضية التي كانت تسمى آنذاك الكيمياء الأنزيمية للكشف عن النشاط في الأنسجة والخلايا تحت المجهر. ومع ذلك ، أصبح التمثيل الغذائي عفا عليه الزمن خلال الثورة الجينية في نهاية القرن الماضي. لكن الآن ، أصبح التمثيل الغذائي ساخنا مرة أخرى.

انظر ، على سبيل المثال ، إلى الخلايا السرطانية. يعتبر التمثيل الغذائي الآن هدفا علاجيا ، وبالتالي ، فإن تحديد النشاط في الخلايا والأنسجة ساخن مرة أخرى. أحد المكونات الرئيسية للمخزن المؤقت للتفاعل هو كحول البولي فينيل ، أو PVA.

يذوب هذا في مخزن الفوسفات بتركيز 18٪ PVA مغبر وسام عند استنشاقه ، لذا تأكد من وزن PVA تحت غطاء الدخان. بسبب ارتفاع تركيز PVA في مخزن الفوسفات ، قم بتسخين زجاجة عازلة التفاعل au bain-marie أثناء التحريك. تأكد من ربط الغطاء بشكل غير محكم على الزجاجة وإلا فقد تنفجر الزجاجة.

قد يستغرق الأمر ما يصل إلى 15 دقيقة قبل أن يذوب PVA تماما في مخزن الفوسفات. إذا كان الأمر كذلك ، فيجب أن يكون المحلول شفافا مع فقاعات هواء صغيرة ناتجة عن التحريك. يمكن سحب محلول PVA اللزج في أنابيب عازلة للتفاعل باستخدام ماصة عريضة.

حافظ على الأنابيب عند 40 درجة مئوية على الأقل أو أعلى لمنع PVA من التصلب. مليلتر واحد من محلول PVA مفيد لحوالي أربعة تدور الخلوي ، أو اثنين من مستحضرات الأنسجة. بالنسبة للمكونات الأخرى للمخزن المؤقت للتفاعل ، يتم إذابة كلوريد النيتروبلو الأصفر التيترازوليوم المعروف أيضا باسم nitroBT ، في خليط من الإيثانول وثنائي ميثيل فورماميد ، أثناء تسخينه في قارورة زجاجية في موقد بنسن.

يجب ألا يغلي المحلول وإلا سينخفض الحجم كثيرا. لذلك لا تترك القارورة لفترة طويلة في اللهب ورجها بانتظام. احتفظ به على الجليد بعد إذابته وانتقل إلى الخطوة التالية بسرعة حيث يتلاشى nitroBT المذاب بسرعة.

NitroBT عبارة عن مسحوق أصفر يقع في قاع القارورة الزجاجية التي تحتوي على الإيثانول و DMF عندما لا يتم إذابتها. يمكنك التحقق كل عدة مرات مما إذا كان nitroBT قد تم إذابته. سيكون الحل بعد ذلك أصفر شفاف.

عند الذوبان ، يمكن سحب nitroBT في القوارير التي تحتوي على محلول PVA. قلبي برفق باستخدام ملعقة رفيعة أو ملعقة رفيعة لخلط nitroBT والمخزن المؤقت. قم بذلك لجميع مكونات المخزن المؤقت للتفاعل خطوة بخطوة المدرجة في الجدول الأول من النص الكامل.

حاول ألا تصنع الكثير من فقاعات الهواء أثناء تقليب مكونات التفاعل في محلول PVA. الحيلة هي التقليب المستمر مع عدم إخراج الملعقة أو الملعقة من المحلول. يجب حماية شركة نقل الإلكترون ، كبريتات ميثيل ميثيل ميثوكسي فينازينيوم ، من الضوء وإذابتها في المخزن المؤقت للتفاعل أخيرا.

اللون الأحمر ل MPMS مناسب للتحقق مرة أخرى مما إذا كانت جميع المكونات قد تم إذابتها بشكل صحيح. أثناء تحضير المخزن المؤقت للتفاعل وتقليب المكونات فيه ، قم بتسخين الشرائح مسبقا لمدة 50 دقيقة في حاضنة تحتوي على ماء دافئ. حافظ على مستوى منخفض من الماء داخل غرفة الحضانة.

مع إغلاق الغطاء ، سيحافظ ذلك على رطوبة بيئة التفاعل. مع فتح الغطاء ، سيحافظ الماء على الشرائح في درجة حرارة دافئة. ضع المخزن المؤقت للتفاعل على مستحضرات الخلية أو الأنسجة باستخدام ماصة زجاجية.

لا تقلق بشأن فقاعات الهواء الصغيرة لأنها ستتدفق إلى السطح ولن تتداخل مع التفاعل في الخلايا أو الأنسجة. حافظ على غطاء غرفة الحضانة مغلقا خلال وقت الحضانة. سيضمن ذلك حدوث التفاعل في بيئة رطبة لمنع المخزن المؤقت PVA من الجفاف.

تحدث معظم تفاعلات نازعة الهيدروجين في تجارب رسم الخرائط الأيضية عند 37 درجة مئوية. احتضان الشرائح في المخزن المؤقت للتفاعل لفترة زمنية محددة مسبقا ، والتي يمكن العثور عليها في الجدول الأول من مقالة النص الكامل. يمكن للمرء أن يرى بسهولة ما إذا كان التفاعل يعمل أم لا حيث ستتحول الخلايا أو الأنسجة إلى اللون الأزرق الداكن أو الأرجواني ، بسبب نشاط نازعة الهيدروجين.

والذي يتحول في النهاية إلى nitroBT عديم اللون غير القابل للذوبان إلى الفورمازول الأزرق الداكن ، الذي يترسب في موقع نشاط نازعة الهيدروجين. يتوقف التفاعل الأنزيمي في ثلاث خطوات. أولا ، يجب استغلال وسط الحضانة الزائد على المنديل.

ثانيا ، يجب غسل وسط الحضانة من شرائح الفحص المجهري باستخدام الغسيل الميكانيكي في مخزن مؤقت للفوسفات من درجة الحموضة 5.3 عند 60 درجة مئوية. ثالثا ، يجب ترك شرائح الفحص المجهري في مخزن مؤقت للفوسفات الطازج بدرجة حموضة 5.3 عند 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. رابعا ، يمكن شطف عازلة الفوسفات باستخدام الصنبور ثم الماء المقطر.

يمكن للمرء أن يرى بسهولة أن المخزن المؤقت للتفاعل ينفجر. يساعد الرقم الهيدروجيني المنخفض للمخزن المؤقت في إيقاف تفاعل نازعة الهيدروجين داخل الخلايا. ضع الشرائح في مخزن مؤقت جديد مرة أو مرتين اعتمادا على مقدار الشرائح التي تعالجها في المرة الواحدة.

اشطف الشرائح أيضا بماء الصنبور وانتهي بالماء المقطر. الآن ، يمكن تجفيف الشرائح على منزلق أكثر تدفئة وإغلاقها. جفف الجانب الخلفي من الشريحة بعناية عن طريق مسحه وضعه على جهاز تسخين منزلق مسخن مسبقا إلى 50 إلى 60 درجة مئوية.

عندما تجف الشرائح ، يمكن استخدام محلول الجلسرين والجلسرين وزلات الغطاء لإحاطة الشرائح والحفاظ عليها. احتفظ بالشرائح في الثلاجة حتى متابعة الحصول على الصورة. هذا صورة مجهرية ملونة لقسم نسيج تمثيلي على شريحة زجاجية تمت معالجتها في التجربة الموضحة في هذا الفيديو.

هذا قسم من الورم الأرومي الدبقي ونازعة هيدروجين lepto هو الإنزيم الذي تم فحصه. ينتج كل نازعة هيدروجين كيان PH وكل كيان يقوم بتحويل جزيء واحد من nitroBT ، ملح التيرازوليوم الأصفر ، إلى جزيء واحد من الفورمازول ، الراسب الأرجواني الموضح في هذه الصورة. يمكن للمرء أن يرى نشاط نازعة هيدروجين اللاكتات العالي داخل الخلايا في الخلايا السرطانية الموضحة باللون الأرجواني الداكن.

الأوعية الدموية لها نشاط أقل ، وهي بيضاء. هذه صورة أحادية اللون لنفس المنطقة من الشريحة. والتي يمكن استخدامها لتحديد نشاط الإنزيم كما هو موضح في البروتوكول.

كلما زاد إنتاج الفورمازان ، كلما كان البكسل أغمق ، وزاد الامتصاص. يمكن بعد ذلك تحويل الامتصاص إلى بيكومول من درجة الحموضة الكيان التي تم إنشاؤها. لذا فإن رسم الخرائط الأيضية سهل القيام به.

إنه سريع جدا ورخيص الثمن. لذا استخدمه في بحثك.