بروتوكول المصحوبة بمرشدين لتوصيف الجراثيم البراز بتسلسل الرنا الريباسي-Amplicon 16S

العام من تسلسل 16S rRNA-Amplicon عالي الإنتاجية هو توصيف تكوين الميكروبيوم العالمي بدءا من عينات البراز. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول التركيب الميكروبي العالمي المرتبط بالعديد من مجالات الاهتمام مثل التمثيل الغذائي والهضم والأمعاء والالتهابات الجهازية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر إحصاء للمجتمعات الميكروبية الهوائية واللاهوائية الموجودة في عينة البراز بما في ذلك تلك البكتيريا التي يصعب زراعتها.

يمكن لهذه الطريقة التعامل في وقت واحد مع أعداد كبيرة من عينات البراز بفضل خط مضخة المعالجة السريعة الخالية من القولون وأسفرت عن تسلسل قوي وقابل للتكرار 16S rRNA-Amplicon. بالنسبة لهذا البروتوكول ، قم بتجميد عينات البراز التي تبلغ حجمها تقريبا حجم ممحاة قلم رصاص. يجب تخزين العينات في أنبوبين من المليلتر مع قطع طرف مسحة التجميع.

قم بتضمين عناصر تحكم سلبية تتكون من مسحات بدون براز وعناصر تحكم داخلية مكررة واحصل على عينات مكررة من عينة البراز الأصلي لتكون بمثابة عنصر تحكم داخلي. ابدأ بإذابة محاليل الاستخراج والتخفيف في درجة حرارة الغرفة جنبا إلى جنب مع عينات البراز وعينات التحكم. بمجرد إذابته ، أضف 250 ميكرولترا من محلول الاستخراج إلى كل أنبوب عينة واخلط البراز في محلول باستخدام دوامة.

قدم عناصر التحكم السلبية للمخزن المؤقت فقط في هذه المرحلة. بعد ذلك ، قم بتسخين العينات لمدة 10 دقائق في حمام مائي مغلي. بعد الحضانة في الماء المغلي ، أضف 250 ميكرولتر من محلول التخفيف إلى كل عينة وقم بتدوير العينات لخلطها.

ثم قم بتخزين أنابيب العينة على أربع درجات مئوية حتى يمكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بإعداد PCRs في محطة عمل ما قبل PCR التي تم تطهيرها من ملوثات الحمض النووي المحتملة مثل القوالب ومكبرات الصوت. قم بتسمية البادئات وفقا للرمز الشريطي الخاص بها وتخفيفها في الماء المقطر المزدوج إلى تركيز 50 ميكرومولار.

قم بتخزين مخزون البرايمر المخفف عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر وقم بإذابة الثلج تماما قبل الاستخدام. لكل عينة ، قم بإعداد صفيحة من 96 بئرا ل 32 تفاعلا في ثلاث نسخ. بعد التسخين إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بتخفيف حصص التمهيدي الأمامي و 32 بادئات عكسية إلى خمسة ميكرومولار ل PCR.

ثم قم بإعداد مزيج PCR أساسي كاف ل 100 تفاعل. امزج 100 ميكرولتر من خمسة ميكرومولار برايمر أمامي مع مليلتر واحد من 2X PCR الرئيسي و 400 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. دوامة هذا الخليط ثم قم بتحميل 15 ميكرولترا من هذا الخليط في كل بئر من الآبار ال 96.

بعد ذلك ، قم بتحميل مجموعات من ثلاثة آبار لكل منها ميكرولتر واحد من خمسة ميكرومولار التمهيدي العكسي. وبالتالي ، قم بتحميل جميع المؤشرات العكسية المختلفة البالغ عددها 32 في اللوحة. ثم أضف إلى كل طبق جيدا أربعة ميكرولترات من عينة الحمض النووي المستخرجة.

يتم ذلك على مقعد نظيف. الآن قم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل مع تمسخ أولي مدته ثلاث دقائق متبوعا ب 35 دورة مع دقيقة واحدة من التمسخ والركوع عند 55 درجة مئوية ودقيقة واحدة من التمديد. انتهي بتمديد نهائي لمدة 10 دقائق.

بعد اكتمال التفاعل ، اعمل في طاولة عمل مخصصة بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). هناك ، اجمع كل مجموعة من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ثلاثية النسخ في أنبوب واحد بسعة 60 ميكرولتر لكل عينة. ثم قم بتشغيل أربعة ميكرولترات من كل عينة على هلام أغروز ملطخ ببروميد الإيثيديوم.

ستظهر Amplicons الموجبة بين 375 و 425 زوجا أساسيا. تظهر الضوابط السلبية وتمت معالجتها جنبا إلى جنب مع الدراسة أمبليكونات إيجابية. حدد تركيزات الحمض النووي لمنتجات التفاعل الإيجابي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

ثم اجمع 500 نانوغرام من الحمض النووي من كل منتج في أنبوب واحد. دوامة هذا الخليط ثم ينفد 200 ميكرولتر على هلام 1٪ كما كان من قبل. الآن استخرج العصابات من الجل بين 375 و 425 زوجا أساسيا.

بعد ذلك ، قم بإعداد المكتبة للتسلسل. قم بقياس التركيز باستخدام مجموعة أدوات الكشف عن الحمض النووي مزدوجة الشريطة عالية الحساسية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة متبوعة باستخدام مجموعة فصل وتحليل عالية الحساسية. ثم قم بتخفيف المكتبة إلى سبعة بيكوملار واجمعها أربعة إلى واحد مع مكتبة تحكم.

الآن بعد أن أصبحت العينة جاهزة للتسلسل ، انقلها إلى آلة التسلسل. تم استخدام الطريقة الموصوفة لإعداد المكتبة من عينات البراز لتحليل ميكروبيوم المرضى في المستشفى الذين يشتبه في إصابتهم بالإسهال المعدي. في موازاة ذلك ، تعرضت عينات البراز أيضا للزراعة التقليدية في مختبر علم الأحياء الدقيقة.

تم تسلسل عينات البراز من البالغين الأصحاء للمقارنة. تم تضمين العديد من عينات المراقبة السلبية ، PCR بدون قالب ، PCR على مسحات نظيفة ومعقمة في محلول الاستخراج والتخفيف و PCR على محاليل الاستخراج والتخفيف المختلطة. كان لكل منها أقل من 118 قراءة إجمالية كانت بشكل أساسي أصناف الميكوبلازم.

بلغ متوسط العينات القياسية أكثر من 10،000 قراءة دون تحديد الميكوبلازما بعد مراقبة الجودة. تم قياس اتساق العينات وتنوعها باستخدام 16 عينة من البراز تم إعدادها باستخدام اثنين من البرايمر الشريطي المختلفين لبناء مكتبتين مختلفتين من كل عينة. كانت نصف العينات إيجابية للسالمونيلا العطيفة أو الشيغيلا في تقنية الاستزراع التقليدية.

باستخدام نتائج تسلسل 16S ، تظهر مخططات المساحة على مستوى الشعبة الاتساق بين المكتبات المصنوعة من نفس العينات المستقلة عن نتائج الزراعة التقليدية. من هذه المجموعة المكونة من 16 عينة مزدوجة ، كشف تحليل الإحداثيات الرئيسي أن أزواج العينات تتماشى بشكل وثيق وأن عينات المزرعة الموجبة لها قيمة PC1 مختلفة بشكل كبير عن عينات الثقافة السلبية. كشف تحليل إضافي للعينات أنه تم العثور على مستويات عالية من البكتيريا البروتينية فقط في المرضى في المستشفى.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية معالجة عدد كبير من عينات البراز في وقت واحد باستخدام استخراج الحمض النووي الخالي من القولون و PCR لإنشاء مكتبات تسلسل شريطية لمنطقة المتغير الميكروبي V4. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل في بيئة منظمة ونظيفة خاصة عند إعداد المكتبات. لا تنس أن العمل مع عينات البراز البشري أمر خطير ويجب دائما ارتداء معدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.