How does an ultracentrifuge create a stronger gravitational field than Earth's gravity?

An ultracentrifuge contains a rotor that rotates at highly controlled speeds, simulating a strong gravitational field. Even a small rotor at relatively low rotational speed can create a force thousands of times stronger than Earth's gravitational field. This magnified field increases the differences in density between particles and solvent, accelerating separation.

What is the difference between step gradients and continuous gradients?

In step gradients, liquids of decreasing density are carefully layered on top of one another, creating distinct boundaries. In continuous gradients, liquids are mixed in varying proportions so density decreases smoothly from the base upwards. Both types keep liquids in separate layers ordered by density during centrifugation.

Why is isopycnic density-gradient centrifugation the most common separation procedure?

Isopycnic density-gradient centrifugation is the simplest and most common procedure for separating cellular organelles using a step gradient. Organelles sediment based on their density, with denser structures descending further. This straightforward approach effectively isolates mitochondria, nuclei, and other cellular structures without destructive force.

How should sucrose solutions be prepared for creating a density gradient?

Sucrose is added in increasing amounts so each solution is more concentrated and denser than the preceding one. Solution densities must fall between the components being separated, with the final solution denser than the densest component. Exact densities depend on the specific organelles or molecules being isolated from the organism.

Why is rate-zonal centrifugation used instead of isopycnic centrifugation for nucleic acids?

Because nucleic acids are denser than sucrose, isopycnic centrifugation cannot separate them from organelles nondestructively. Rate-zonal centrifugation uses a continuous gradient and separates components based on sedimentation rates, which depend on both density and conformation. This technique preserves nucleic acid integrity while achieving separation.

What gradient medium is used to separate nucleic acid strands by density?

Cesium chloride gradients, typically ranging from 1.65 to 1.75 g/mL, are used to separate nucleic acid strands. Sucrose cannot be used because it is less dense than nucleic acids. Cesium chloride provides sufficient density and low viscosity, allowing separation of DNA strands based on guanine-cytosine versus adenine-thymine content.

How are fractionated cellular components collected after ultracentrifugation?

After centrifugation, cellular components form discrete bands between solution layers. Fractions can be collected using a syringe or by puncturing the tube bottom with a sterilized needle and collecting outflow in sterile tubes. Isolated components can then be stored at -80 degrees Celsius for further analysis or experimentation using chromatography based biomolecule purification methods.

الكثافة التدرج الفائق الطرد المركزي

0 مشاهدة08:42 دقيقة

الطرد المركزي الفائق المتدرج للكثافة هو تقنية شائعة تستخدم لعزل وتنقية الجزيئات الحيوية وهياكل الخلايا. تستغل هذه التقنية حقيقة أنه في حالة التعليق ، ستترسب الجسيمات الأكثر كثافة من المذيب ، في حين أن الجسيمات الأقل كثافة ستطفو. يتم استخدام جهاز طرد مركزي فائق السرعة لتسريع هذه العملية من أجل فصل الجزيئات الحيوية داخل تدرج الكثافة ، والذي يمكن إنشاؤه عن طريق وضع طبقات من السوائل ذات الكثافة المتناقصة في أنبوب الطرد المركزي.

سيغطي الفيديو مبادئ الطرد المركزي الفائق لتدرج الكثافة ، بما في ذلك إجراء يوضح تحضير العينة ، وإنشاء تدرج السكروز ، والطرد المركزي الفائق ، وجمع التحليلات المجزأة. يناقش قسم التطبيقات عزل المجمعات متعددة البروتينات ، وعزل مجمعات الحمض النووي ، والفصل باستخدام تدرجات كثافة كلوريد السيزيوم.

يعد الطرد المركزي الفائق المتدرج للكثافة نهجا شائعا لعزل وتنقيته من هياكل الخلايا للتجارب الكيميائية الحيوية. تستخدم هذه التقنية جهاز طرد مركزي عالي السرعة أو فائق السرعة لفصل المكونات الخلوية بشكل غير مدمر في تدرج الكثافة. يصف هذا الفيديو مبادئ الطرد المركزي الفائق لتدرج الكثافة ، ويوفر إجراء عاما باستخدام تدرج السكروز ، ويناقش بعض التطبيقات.

لنبدأ بفحص مبادئ أجهزة الطرد المركزي الفائقة وتدرجات الكثافة. يحتوي المعلق على جزيئات في مذيب سائل. بسبب الجاذبية ، تخرج الجسيمات أكثر كثافة من رواسب المذيبات بينما تطفو الجسيمات الأقل كثافة من المذيب. كلما زاد الاختلاف في الكثافة بين الجسيم والمذيب ، زادت سرعة الفصل.

يحتوي جهاز الطرد المركزي الفائق على وحدة تسمى الدوار ، والتي تدور بسرعات يتم التحكم فيها بدرجة عالية ، وتحاكي مجال جاذبية قوي. في هذا المجال ، يتم تضخيم الاختلافات في الكثافة بين الجسيمات والمذيب.

تعتمد قوة المجال على سرعة الدوران. حتى الدوار الصغير بسرعة دوران منخفضة نسبيا يمكن أن يخلق قوة أقوى بآلاف المرات من مجال جاذبية الأرض.

إذا كان الأنبوب يحتوي على عدة سوائل ذات كثافات مختلفة ، فإن الطرد المركزي سيبقيها في طبقات منفصلة بترتيب الكثافة ، مع وجود السائل الأكثر كثافة الأقرب إلى القاعدة. تسمى هذه الطبقات من السوائل المتعددة "تدرج الكثافة". هناك نوعان. في التدرجات المتدرجة ، يتم وضع السوائل ذات الكثافة المتناقصة بعناية فوق بعضها البعض. في التدرجات المستمرة ، يتم خلط السوائل بنسب متفاوتة ، وبالتالي تنخفض الكثافة بسلاسة من القاعدة إلى الأعلى.

يمكن فصل العضيات الخلوية باستخدام تدرج تدريجي ، من خلال "الطرد المركزي المتدرج بكثافة متساوي البكال". هذا هو أبسط إجراء الطرد المركزي وأكثرها شيوعا.

يستخدم هذا الإجراء لفصل الهياكل الخلوية. كلما زادت كثافة العضية ، كلما نزلت أكثر - مع وجود الميتوكوندريا في الأعلى والأحماض النووية باتجاه الأسفل.

الآن بعد أن تعرفت على المبادئ الكامنة وراء هذه التقنية ، دعنا نراها في المختبر.

قبل بدء الإجراء ، يجب ملاحظة تصنيفات السرعة والكثافة الخاصة بالشركة المصنعة ، وفحص جهاز الطرد المركزي الفائق بحثا عن التآكل. يستخدم هذا الإجراء دوار دلو متأرجح.

أولا ، يتم تحضير المادة الخلوية عن طريق تجانس الخلايا ، والتي تطلق عضياتها بشكل غير مدمر. يمكن تجزئة الجانس من خلال الطرد المركزي الأولي منخفض السرعة ، لإزالة المكونات منخفضة الكثافة. بعد ذلك ، يتم تحضير محاليل السكروز.

يضاف السكروز بكميات متزايدة بحيث يكون كل محلول أكثر تركيزا ، وبالتالي أكثر كثافة ، من المحلول السابق. تعتمد الكثافة الدقيقة للمحاليل على المكونات المراد فصلها ، والتي تختلف بين الكائنات الحية. يجب أن يكون للمحاليل كثافة بين تلك الموجودة في المكونات المراد فصلها ، مع أن يكون المحلول الأخير أكثر كثافة من المكون الأكثر كثافة في المادة التحليلية. يتم وصف تقنيات فصل المكونات الأكثر كثافة من السكروز ، مثل الأحماض النووية ، في التطبيقات.

يتم الآن إنشاء تدرج السكروز في أنبوب طرد مركزي نظيف. تستخدم ماصة لاستخلاص محلول السكروز الأكثر تركيزا. مع تثبيت الأنبوب في وضع مستقيم ، يتم وضع طرف الماصة عاليا على الحائط ، ويتم توزيع السائل بثبات لأسفل. من المهم أن تظل منطقة العمل خالية من الاهتزازات والاضطرابات الأخرى.

بعد استبدال الطرف ، تتم إضافة المحاليل المتبقية بترتيب تقليل الكثافة. يتم الاستغناء عنها بعناية لتشكيل طبقات مميزة وتجنب الخلط. أخيرا ، يضاف حوالي نصف مليلتر من العينة الخلوية فوق التدرج ، ويتم وزن الأنبوب. يستخدم هذا لموازنة توزيع الوزن ، الخطوة التالية من العملية.

يجب أن يبدأ الطرد المركزي في أسرع وقت ممكن. يتم وضع الأنبوب في الدوار ، والذي يتم موازنته بعد ذلك عن طريق وضع محاليل فارغة متساوية الوزن في فتحات متعارضة. يتم وضع الدوار في جهاز الطرد المركزي الفائق والنظام مختوم. يتم ضبط درجة الحرارة وسرعة الدوران والوقت. القيم النموذجية هي 4 درجة مئوية بقوة تزيد عن 100,000 × جم لمدة 16 ساعة.

بعد الطرد المركزي ، يتم سحب الأنبوب من الدوار ، مع الحرص على إبقائه في وضع مستقيم ودون إزعاج. تم تجزئة المكونات الخلوية المختلفة إلى نطاقات منفصلة بين طبقات المحلول. يمكن جمع الكسور باستخدام حقنة. بالتناوب ، يمكن ثقب الجزء السفلي من الأنبوب بإبرة دقيقة ومعقمة وجمع التدفق في أنابيب معقمة. تم الآن عزل المكونات الخلوية. يمكن تخزينها عند -80 درجة مئوية.

الآن بعد أن رأينا الإجراء الأساسي ، دعنا نلقي نظرة على بعض التطبيقات.

التطبيق النموذجي هو عزل المجمعات متعددة البروتينات في الخلايا النباتية. في هذا المثال ، يتم عزل المجمعات المسؤولة عن تدفق الإلكترون الدوري من الثايلاكويد ، موقع تفاعل الضوء في عملية التمثيل الضوئي. يستخدم هذا الإجراء محاليل منفصلة من 14 إلى 45٪ سكروز. يحدث الطرد المركزي أكثر من 100,000 × جم لمدة 14 ساعة عند 4 درجات مئوية.

نظرا لأن الأحماض النووية أكثر كثافة من السكروز ، فإن الطرد المركزي متساوي البتني لا يمكنه فصلها عن العضيات بشكل غير مدمر.

يتم استخدام تقنية مختلفة ، تعرف باسم "الطرد المركزي في منطقة المعدل". يفصل العضيات بناء على معدلات ترسبها ، والتي لا تعتمد فقط على كثافتها ، ولكن أيضا على مطابقتها. يتم استخدام تدرج مستمر لفصل المكونات بناء على هذه الخاصية.

وتتشابه الخطوات الإجرائية مع تلك الخاصة بحالات متساوي البتنقية. في هذا المثال ، يتم عزل مجمعات الحمض النووي الريبي الريبوسوم باستخدام تدرج مستمر من 5٪ إلى 20٪ ، يتم طرده بالطرد المركزي عند 230،000 × جم. يتم مقاطعة الطرد المركزي بعد بضع ساعات لمنع هطول الأمطار.

يمكن فصل خيوط الحمض النووي عن بعضها البعض على أساس الكثافة.

وذلك لأن الخيوط الغنية بالجوانين والسيتوزين أكثر كثافة من تلك الغنية بالأدينين والثيامين. في هذه الحالة ، لا يمكن صنع التدرج من السكروز ، لأن السكروز أقل كثافة من الأحماض النووية. بدلا من ذلك ، يتم استخدام تدرجات كلوريد السيزيوم ، عادة من 1.65 إلى 1.75 جم / مل ، حيث أن لها كثافة كافية ولزوجة منخفضة.

هنا نرى الحمض النووي للعوالق يتم تنقية باستخدام تدرج كلوريد السيزيوم المستمر. يحدث الطرد المركزي عند أكثر من 1،000،000 × جم لمدة 18 ساعة تحت الفراغ.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول الطرد المركزي الفائق مع تدرج كثافة السكروز. يجب أن تفهم الآن كيفية عمل تدرج الكثافة ، وكيفية إنشاء تدرج خطوة ، وكيفية تحميل وتشغيل جهاز طرد مركزي فائق. شكرا للمشاهدة!

الطرد المركزي الفائق المتدرج للكثافة هو تقنية شائعة تستخدم لعزل وتنقية الجزيئات الحيوية وهياكل الخلايا. تستغل هذه التقنية حقيقة أنه في حالة التعليق ،…