الغربية النشاف بروتوكول لإعداد صغيرة من الخلايا الجذعية المكونة للدم

الهدف الزائد لبروتوكول النشاف الغربي هذا هو إجراء بقع غربية على أعداد صغيرة من الخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلايا الجذعية المكونة للدم مثل وجود أو وفرة بروتينات معينة أو تنشيط مسارات الإشارات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتطلب أقل من 20،000 خلية ، وبالتالي هناك حاجة إلى عدد أقل من لتحليل مجموعات نادرة من الخلايا الأولية.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نحاول إيجاد طرق لتقليل عدد الفئران التي نحتاج إلى استخدامها في تحليلات الخلايا الجذعية المكونة للدم. سيوضح الإجراء Xiongwei Cai ، وهو ما بعد الدكتوراه من مختبري. استخدم دوار دلو متأرجح لأجهزة الطرد المركزي 1.5 مليلتر من الأنابيب التي تحتوي على خلايا جذعية وسلفية مكونة للدم مرتبة عند 500 ضعف الجاذبية لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

بمجرد انتهاء الطرد المركزي ، تخلص من كل المواد الطافية باستثناء 100 ميكرولتر ، دون إزعاج حبيبات الخلية. إذا كان هناك أقل من 5 ، 000 خلية ، وكان حجم العينة التي تم فرزها أقل من 0.2 مليلتر ، فقم أولا بنقل الخلايا إلى أنابيب PCR منخفضة الارتباط 0.2 مليلتر قبل الطرد المركزي. ومع ذلك ، إذا كان هناك أقل من 5000 خلية ، ولكن حجم العينة التي تم فرزها أكثر من 0.2 مليلتر ، فقم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 ضعف الجاذبية لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي ، تخلص من جميع المواد الطافية باستثناء 200 ميكرولتر. ثم أعد تعليق الحبيبات و 200 ميكرولتر المتبقية من المادة الطافية. بعد ذلك ، قم بنقل تعليق الخلية إلى أنابيب PCR سعة 0.2 مليلتر ومرة أخرى ، أجهزة الطرد المركزي.

ثم أعد تعليق الحبيبات في 20 إلى 30 ميكرولتر من المادة الطافية وتخلص من الباقي. إذا لزم الأمر ، أضف محلول ملحي مخزن بالفوسفات في مصل بقري جنيني 2٪ ، أو 2٪ ألبومين مصل بقري إلى الخلايا العالقة. ثم استخدم عداد الخلايا الآلي لتحديد التركيز الخلوي باستخدام اثنين إلى خمسة ميكرولتر من الخلايا العالقة.

بعد ذلك، استخدم طرف ماصة سعة 20 أو 100 ميكرولتر لنقل حجم 500 و1 و000 و2,000 من الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 ملليلتر. استخدم دوار دلو متأرجح لطرد الخلايا عند أربع درجات مئوية عند 500 ضعف الجاذبية لمدة خمس دقائق. ثم اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإذابة الفوسفاتيز ومثبط البروتيازوم و DMSO لتحضير محلول مخزون 100 ضعف.

بعد ذلك ، قم بتخفيف المخزن المؤقت لعينة Laemmli رباعي الأضعاف بأحجام مكافئة من الماء المقطر لإنشاء مخزن مؤقت لعينة Laemmli ذو ضعين. ثم أضف كميات مناسبة من محلول مخزون 100 ضعاف من الفوسفاتيز ومثبط البروتيازوم لضبط التركيز النهائي على مثبطات أضعاف ، واثنين من المخزن المؤقت لعينة Laemmli. اضبط حجم المادة الطافية المتبقية في الأنبوب بحيث تؤدي إضافة أحجام متساوية من اثنين من المخزن المؤقت Laemmli جنبا إلى جنب مع مثبط الفوسفاتيز والبروتيازوم إلى تحقيق تركيز نهائي يبلغ 500 خلية لكل ميكرولتر ومخزن Laemmli ذو أضعاف واحد.

ثم أعد التعليق لتشكيل المحلل. قبل تحميل الجل ، قم بتسخين المحللة للعينة عند 95 درجة مئوية في كتلة حرارية لمدة خمس دقائق. باستخدام البروتوكولات القياسية ، يتم التكاثر الكهربائي من واحد إلى 40 ميكرولتر من المحللة ، أي ما يعادل 500 إلى 20 ، 000 خلية من خلال صفحة SDS عند 100 فولت.

بعد معالجة غشاء بولي فينيلدين بالميثانول لمدة ثوان ، اغسل الغشاء بالماء المقطر لفترة وجيزة. ثم انقل البروتين من الجل إلى الغشاء وفقا للتعليمات المقدمة من الشركة المصنعة لجهاز النقل. بعد النقل ، قم بسد الغشاء بملليلترين من ألبومين مصل الأبقار 2٪ والمحلول الملحي الممخزن بالفوسفات بنسبة 0.1٪ بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية وفقا للبروتوكالات القياسية.

بعد سد الغشاء ، احتضنه بأجسام مضادة مخففة طوال الليل عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل الغشاء ثلاث مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات بنسبة 0.1٪ Tween 20 لمدة خمس دقائق لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، احتضن الغشاء بملليلترين من المخزن المؤقت الكيميائي المحسن لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

كشف الإشارات باستخدام نظام التصوير. لمقارنة إشارات الأكتين بيتا ، تم تحضير المحللات من الخلايا الجذعية المكونة للدم في البول والخلايا السلفية وإخضاعها لتحليل المؤامرة الغربية. من الواضح من اللطخة الأمينية أن هناك انخفاضا في إشارة بيتا أكتين من المحللات المحضرة من 2 ، 000 إلى 500 سلف مكونة للدم والخلايا الجذعية المحملة في آبار 1.5 ملم على هلام صفحة SDS بنسبة 12٪.

علاوة على ذلك ، لمقارنة إشارات الأكتين بيتا التي تم الحصول عليها من أحجام مختلفة من الآبار المصبوبة على الجل. تم تحميل المحللات في آبار 1.5 وثلاثة ملليمترات على الجل ثم خضعت لتحليل اللطخة الغربية. تظهر اللطخة أن إشارة بيتا أكتين التي تم الحصول عليها من المحللة المحضرة من 500 أسلاف مكونة للدم محملة في بئر 1.5 ملم أقوى بكثير مما كانت عليه عند تحميلها في بئر ثلاثة ملليمترات.

بعد ذلك ، لمقارنة إشارات عامل بدء حقيقيات النواة 4G ، الأكتين وفسفرة البروتين الريبوزومي S6 استجابة لتحفيز عامل الخلايا الجذعية للسيتوكين ، تم تحليل المحللات التي تم الحصول عليها بواسطة اللطخة الأمينية. تظهر اللطخة وجود كثافة إشارة أقوى لجميع البروتينات الثلاثة في الخلايا المكونة للدم مع تحفيز عامل الخلايا الجذعية للسيتوكين. بالمقارنة مع التحكم في المختبر ، من الواضح أيضا أن هناك كثافة إشارة متزايدة لجميع البروتينات الثلاثة من أحجام مختلفة من الخلايا الجذعية المكونة للدم.

بمجرد إتقان ذلك ، يمكن القيام بذلك تقنيا في 48 ساعة. إذا تم التعامل معه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر حساب الخلايا بدقة وتوجيه خلايا المحللة باستخدام مخزن مؤقت للتحميل.

بعد هذا التطور ، يتم تفكيره تقنيا للباحثين في مجال أبحاث الخلايا الجذعية لاستكشاف مسارات الإشارة في عدد صغير من الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية القيام بالتخطيط الغربي بعدد صغير من قطع العناوين. كن حذرا مع المناطق التي تستخدمها لصفحة SDS.

شكرا لك على المشاهدة. حظا سعيدا في تجاربك.