إنزيم TET2 انقسام هندسيا للحمض النووي الكيميائية إيندوسيبلي هيدروكسيميثيليشن ويعيد البناء جينية

وترد بروتوكولات مفصلة لإدخال إنزيم هندسيا سبليت-TET2 (عصير التفاح) في خلايا الثدييات هيدروكسيميثيليشن الحمض النووي إيندوسيبلي الكيميائية وإعادة عرض جينية.

الهدف العام من هذه السلسلة من التجارب هو إدخال إنزيم TET2 مقسم هندسيا يسمى CiDER في خلايا الثدييات لتعديل الحمض النووي المحفز مثل هيدروكسي ميثيل وكذلك إعادة تشكيل الوراثة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم التخلق مثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن إنزيم SPLIT-TET2 المصمم هندسيا يسمح بالتحكم الزمني في أكسدة 5-ميثيل سيتوزين وإعادة التشكيل اللاحق للحالات اللاجينية في خلايا الثدييات باستخدام المضافات الكيميائية. لبدء هذا الإجراء ، قم بزراعة خط خلوي ملتصق في DMEM مكملا بنسبة 10٪ FBS معطل بالحرارة بالإضافة إلى 100 وحدة لكل مليلتر من البنسلين والستربتومايسين.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. قم بنقل الخلايا باستخدام بلازميد CiDER كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي، استبدل الوسائط المحتوية على كاشف الإرسال ب DMEM كامل جديد. لتحفيز الخلايا كيميائيا ، أضف 20 ميكرولترا من الرابامايسين المخفف إلى الخلايا المنقولة التي يتم الاحتفاظ بها في ملليلترين من الوسط للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 200 نانو مولار. لإجراء قياس التدفق الخلوي ، قم بإعادة تعليق الخلايا المنقولة والرابامايسين في المخزن المؤقت FACS.

بالنسبة للمجموعة الضابطة، استخدم الخلايا التي تعبر عن CiDER بدون علاج الرابامايسين. إصلاح الخلايا وتنفذها كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم أضف اثنين من حمض الهيدروكلوريك العادي إلى الخلايا لتشويه طبيعة الحمض النووي لمدة 10 دقائق.

بعد تحييد الخلايا وحظرها كما هو موضح في بروتوكول النص ، أضف الجسم المضاد المخفف المضاد ل 5hmC إلى الخلايا. احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا باستخدام عازلة FACS ثلاث مرات.

قم بإزالة المخزن المؤقت FACS جيدا. أضف جسما مضادا ثانويا مترافقا بالفلوروفور المخفف لتحليل FACS واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الخلايا باستخدام عازلة FACS ثلاث مرات.

بعد الغسيل ، تكون العينات جاهزة لتحليل FACS. عزل الحمض النووي الجيني من الخلايا المنقولة والناتجة عن الراباميسين باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي التجارية. بالنسبة للمجموعة الضابطة ، استخدم الخلايا المنقولة CiDER بدون علاج الرابامايسين.

سخني الفرن المفرج إلى 80 درجة مئوية. انقع غشاء النيتروسليلوز مسبقا في ماء مقطر مزدوج ثم في محلول SSC 6X لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بتحميل 60 ميكرولترا من كميات متساوية من الحمض النووي إلى لوحة PCR سعة 96 بئرا.

أضف 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت TE إلى الآبار المتبقية. قم بعمل تخفيفات تسلسلية مزدوجة عموديا على اللوحة المكونة من 96 بئرا عن طريق نقل 30 ميكرولترا من المحلول في الصف الأول إلى نفس موضع العمود في الصف الثاني. امزج مرة أخرى وانقل 30 ميكرولترا من المحلول إلى الآبار في الصف التالي حتى يتم الوصول إلى الحدود.

ثم قم بإزالة آخر 30 ميكرولتر من البئر. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من هيدروكسيد الصوديوم المولي و 10 مللي مولار EDTA لكل بئر. أغلق الطبق وسخن الخليط لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية لتغيير طبيعة الحمض النووي على الوجهين تماما.

قم بتبريد العينات على الفور على الجليد. أضف 50 ميكرولترا من أسيتات الأمونيوم المثلجة الباردة إلى كل بئر واحتضانها على الثلج لمدة 10 دقائق. في هذه الأثناء ، قم بتجميع جهاز اللطخة النقطية باستخدام الغشاء المنقوع مسبقا.

قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي باستخدام مكنسة كهربائية كاملة. اغسل الغشاء بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE إلى كل بئر من جهاز اللطخة النقطية. قم بتشغيل المكنسة الكهربائية لإزالة المخزن المؤقت TE.

بعد ذلك ، قم بتحميل الحمض النووي المشوه على كل بئر من جهاز اللطخة النقطية. قم بتشغيل المكنسة الكهربائية لإزالة المحلول. اغسل الغشاء بإضافة 200 ميكرولتر من 2X SSC وقم بإزالة المحاليل المتبقية تماما باستخدام فراغ.

تفكيك جهاز اللطخة النقطية. ثم أخرج الغشاء واشطف الغشاء بالكامل ب 20 مل من 2X SSC. جفف الغشاء في الهواء لمدة 20 دقيقة.

لمزيد من تجفيف الغشاء ، اخبزه على حرارة 80 درجة تحت الفراغ لمدة ساعتين. أضف محلول الانسداد إلى الغشاء واحتضنه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من محلول الحجب ، أضف الأجسام المضادة المخففة 5-hmC أو 5-mC إلى الغشاء واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

اغسل الغشاء باستخدام TBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لإزالة الأجسام المضادة المتبقية. بعد إزالة TBST جيدا ، أضف جسما مضادا ثانويا مترافقا HRP إلى الغشاء. احتضان الغشاء لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

اغسل الغشاء باستخدام TBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق. أخيرا ، أضف ركيزة النشاف الغربي ECL إلى الغشاء لتصور إشارات 5-hmC باستخدام كاشف التلألؤ الكيميائي. يتم عرض نتيجة القياس الكمي التمثيلية لإنتاج 5-hmC بوساطة CiDER عن طريق قياس التدفق الخلوي.

تظهر الخلايا التي تعبر عن CiDER فقط في ظل الظروف المعالجة بالراباميسين زيادة كبيرة في مستويات 5-hmC. تظهر هنا نتيجة تمثيلية للتغير العالمي لمستوى 5-hmC في مجموعة الخلايا بأكملها عن طريق اختبار اللطخة النقطية. يتم تصور التحكم في التحميل عن طريق تلطيخ الإيثيلين الأزرق للكميات الإجمالية من الحمض النووي المدخل.

توضح النتائج أن علاج الرابامايسين يحفز إنتاجا قويا ل 5-hmC في خلايا HEK293T التي تعبر عن CiDER مع نشاط خلفية ضئيل. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أسبوع إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم التخلق لاستكشاف الوظيفة الخلوية دون تغيير الشفرة الجينية واستكشاف علاقات النمط الجيني والنمط الظاهري في الأنظمة البيولوجية المختلفة.