التصوير عالية الدقة 3D الشبكة العصبية الجزر البنكرياس البشري

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إظهار طريقة محسنة وسلبية للتنظيف البصري مناسبة للاستخدام مع أنسجة البنكرياس البشري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، المتعلقة بمرض السكري ، من خلال توفير تفاصيل حول تعصيب الجزر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن طريقة المقاصة تضمن شفافية أنسجة البنكرياس البشري لاستخدامها في التصوير متحد البؤر عالي الدقة.

للبدء ، قم بإصلاح عينة البنكرياس عن طريق وضعها في 4٪ بارافورمالدهيد محضرة حديثا ، واحتضان العينة عند أربع درجات مئوية لمدة 48 ساعة. بعد ذلك ، قم بتبريد قارورة عن طريق وضعها في دلو به ثلج. ثم ضع الدلو فوق لوحة التحريك المغناطيسية.

تأكد من أن القارورة مسطحة ، وأضف قضيب تحريك مغناطيسي. صب 147.8 مل من الماء المقطر المثلج منزوع الأيونات في القارورة. ثم أضف 20 مل من 0.1 مولار PBS ، و 20 ملليلترا من محلول أكريلاميد مثلج بنسبة 40٪ ، و 12.2 مل من محلول بارافورمالدهيد بنسبة 16٪ ، و 250 ملليغرام من بادئ VA-044.

امزج محلول الهيدروجيل بالكامل لمدة 10 دقائق على الأقل. بعد ذلك ، ضع أنبوبا مخروطي سعة 15 مليلترا في الجليد بجوار القارورة التي تحتوي على محلول الهيدروجيل. ماصة 14 مل من محلول المونومر في الأنبوب.

وأضف قطعة واحدة من عينة الأنسجة الثابتة والمقطعة. ثم قم بتغطية الأنبوب. احتضان العينة في محلول المونومر لمدة 3 أيام عند أربع درجات مئوية ، مع حمايتها من الضوء.

بعد الحضانة ، ضع العينة على الجليد. بعد ذلك ، قم بتوصيل الأنابيب بخزان النيتروجين من خلال محبس. أثناء الاحتفاظ بالعينة على الجليد ، استخدم بعناية إبرة تحت الجلد عيار 18 لاختراق غطاء أنبوب مخروطي يحتوي على العينة على جانب واحد.

أدخل الإبرة في الأنبوب حتى تصبح تحت سطح محلول المونومر السائل. ثم استخدم إبرة أخرى تحت الجلد عيار 18 لثقب الجانب الآخر من الغطاء ، لكن لا تسمح لها بالغمر في المحلول ، بحيث تكون بمثابة فتحة تهوية. قم بتوصيل الأنبوب من خزان النيتروجين بالإبرة تحت الجلد المغمورة تحت الهيدروجيل ، وقم بتشغيل النيتروجين ببطء ، حتى يغلي بثبات عبر السائل.

بمجرد إزالة الأكسجين ، قم بإزالة الإبرتين بسرعة ، وقم بتغطية الغطاء بغشاء البارافين ، لمنع أي تبادل إضافي للغازات بين الأنبوب والبيئة. أخيرا ، ضع العينة في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية ، لمدة ثلاث ساعات ، لبلمرة الهيدروجيل. بعد البلمرة ، اسكب أيا من الهيدروجيل المتبقي.

بعد ذلك ، اغسل العينة في 3 إلى 5 تبادلات من 0.01 مولار PBS لمدة 15 دقيقة في كل خطوة غسيل. بمجرد غسلها ، انقل العينة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على 40 مل أو مخزن مؤقت للتخليص. احتضان العينة في مخزن المقاصة عند 37 درجة مئوية وقم بتغيير العينة إلى مخزن مؤقت للمقاصة الطازجة كل يومين.

للتحقق من التنظيف المناسب ، امسك العينة في ضوء وتأكد من أن العينة تسمح بمرور الضوء ولكنها تحتفظ ببعض اللون البني في المناطق الخارجية الخارجية. ستظهر عينة أكثر من اللازم مهترئة عند الحواف وسيكون الملمس ناعما جدا عند التقاطها بالملقط. من الشائع أن يتم مسح العينة بشكل غير متساو.

استبدل المخزن المؤقت للمقاصة ب 40 ملليلتر 0.01 مولار PBS ، ووضع العينات على شاكر عند 60 دورة في الدقيقة ليوم واحد في درجة حرارة الغرفة. قم بإجراء أربعة إلى خمسة تغييرات في المخزن المؤقت واترك الغسيل النهائي يستمر طوال الليل. بعد ذلك ، قم بإعداد مخزن تلطيخ PACT في أنبوب مسطح القاع سعة 2 مليلتر وأضف 2٪ مصل طبيعي إلى 1 مليلتر من المخزن المؤقت PACT الأساسي.

بعد ذلك ، أضف ما يقرب من خمسة أضعاف الكمية القياسية من الجسم المضاد الأولي إلى المخزن المؤقت للتلطيخ. باستخدام ملعقة ، قم بإزالة العينة من مخزن الغسيل وامسح المخزن المؤقت الزائد على منشفة ورقية. ضع العينة في الأنبوب بمحلول الجسم المضاد الأساسي ، واحتضنها في المحلول لمدة يومين إلى أربعة أيام في درجة حرارة الغرفة ، على شاكر ، عند 60 دورة في الدقيقة.

بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الجسم المضاد وأضف 0.01 مولار PBS. اغسل العينات جيدا على الخلاط عند 60 دورة في الدقيقة ، وقم بتغييرها إلى مخزن مؤقت جديد أربع إلى خمس مرات واترك الغسيل النهائي على الخلاط طوال الليل. بعد ذلك ، أضف الجسم المضاد الثانوي عند 1 إلى 200 في مخزن تلطيخ PACT مع مصل مضاف بنسبة 2٪.

استخدم ملعقة لإزالة العينة من مخزن الغسيل وامسح المخزن المؤقت الزائد على منشفة ورقية. ثم ضع العينة في الأنبوب بمحلول الجسم المضاد الثانوي. قم بحماية العينة من الضوء أثناء احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة على شاكر عند 60 دورة في الدقيقة لمدة يومين.

بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الجسم المضاد واستبدله ب 0.01 مولار PBS. اغسل العينات جيدا على الخلاط عند 60 دورة في الدقيقة ، وقم بتغييرها إلى مخزن مؤقت جديد أربع إلى خمس مرات ، واترك الغسيل النهائي على الخلاط طوال الليل. للبدء ، قم بإعداد المخزن المؤقت للمحلول المتطابق لمعامل الانكسار عن طريق وزن 11 جراما من وسط التدرج غير الأيوني ونقله بعناية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا.

ثم أضف 5 ملليلتر من محلول الفوسفات المولي 0.02 باستخدام ملعقة لإطلاق الهواء من وسط تدرج الكثافة غير الأيونية المسحوق. إذا لزم الأمر ، ارفع الحجم إلى 10 ملليلتر ، باستخدام المزيد من المخزن المؤقت للفوسفات 0.02 مولار ، واخلطه بملعقة ، ثم اكشط الفائض من الملعقة في الأنبوب. احتضان المخزن المؤقت عند 37 درجة مئوية حتى يذوب تماما ، وقم بقلبه وخلطه برفق بشكل دوري.

انقل العينات إلى محلول مطابقة معامل الانكسار واحتضانها على مقعد محمي من الضوء لمدة يومين إلى أربعة أيام قبل التصوير. قبل التصوير مباشرة ، ضع كمية صغيرة من محلول مطابقة معامل الانكسار في شريحة حجرة سفلية ذات ثمانية أغطية آبار. ثم أضف العينة إلى البئر وقم بتغطية الشريحة.

في البنكرياس البشري ، يمكن تحديد الجزر بالأنسولين والجلوكاجون والجرانا الثلاثة المفرزة لخلايا بيتا أو خلية ألفا أو جميع خلايا الغدد الصماء على التوالي. تظهر خلايا شوان بيضاء ، وتظهر خلايا الغدد الصماء ملطخة إما بالأنسولين أو الجلوكاجون. تبرز الأعصاب ، التي تسير بجوار الأوعية الدموية في محيط الجزيرة كخطوط بيضاء وتمتد إلى الجزر.

هنا ، يمكن رؤية الاتصال بين خلايا شوان وخلايا الغدد الصماء بوضوح. هنا ، تم تلطيخ عينة تم إعدادها باستخدام الطرق الموضحة في هذا الفيديو للببتيد المعوي النشط للأوعية الدموية وتم تصويرها باستخدام مجهر الورقة الضوئية. تظهر الألياف العصبية بوضوح بدقة عالية وتظهر وهي تلف قناة في المقدمة وعقدة في الخلفية.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام مناطق البنكرياس acinar الخالية من القنوات والأوعية الرئيسية.