الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد
الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد (2DGE) هو تقنية يمكنها حل آلاف الجزيئات الحيوية من الخليط. تتضمن هذه التقنية طريقتين منفصلتين متميزتين تم إقران…
الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد (2DGE) هو تقنية يمكنها حل آلاف الجزيئات الحيوية من الخليط. تتضمن هذه التقنية طريقتين منفصلتين متميزتين تم إقرانها معا: التركيز المتساوي الكهربي (IEF) والرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد كبريتات الصوديوم (SDS-PAGE). هذا يفصل المركبات فيزيائيا عبر محورين من الهلام من خلال نقاطها متساوية الكهرباء (خاصية كهروكيميائية) وأوزانها الجزيئية.
يغطي الإجراء في هذا الفيديو المفاهيم الرئيسية ل 2DGE وإجراء عام لتوصيف تكوين محلول بروتين معقد. يتم عرض ثلاثة أمثلة لهذه التقنية في قسم التطبيقات ، بما في ذلك اكتشاف المؤشرات الحيوية لبدء المرض وتقدمه ، ومراقبة العلاج لدى المرضى ، ودراسة البروتينات بعد تعديل ما بعد الترجمة (PTM).
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد ، أو ثنائي الأبعاد ، هو تقنية تستخدم طريقتين منفصلتين متميزتين يمكنهما فصل آلاف البروتينات عن خليط واحد. إحدى التقنيات ، SDS-PAGE أو الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد كبريتات الدوديسيل الصوديوم ، لا يمكنها فصل الخلائط المعقدة بشكل كامل بمفردها. يجمع الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد SDS-PAGE بطريقة ثانية ، التركيز المتساوي الكهربي أو IEF ، والتي تنفصل بناء على النقاط متساوية الكهرباء ، مما يسمح بحل جميع البروتينات المحتملة في محللة الخلية. سيظهر هذا الفيديو مبادئ الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد ، وهو إجراء عام ، وبعض تطبيقاته الطبية الحيوية.
يبدأ الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد ب IEF كبعد أول. لكل بروتين قيمة الأس الهيدروجيني ، تسمى النقطة المتساوية الكهربية أو pI ، حيث صافي الشحنة يساوي صفرا. عندما يتعرض البروتين لمجال كهربائي ، فإنه سيتحرك نحو القطب الكهربائي بشحنة معاكسة. يتم تحميل عينات ذات أهمية على تدرج الأس الهيدروجيني الثابت ، أو IPG ، الشرائط التي تحتوي على أمفوليتات مدمجة ، جزيئات تحتوي على مجموعات حمضية وقاعدية. ثم يتم تطبيق مجال كهربائي على شريط تدرج الأس الهيدروجيني ، مما يتسبب في هجرة البروتينات حتى تصل إلى قيمة الأس الهيدروجيني المطابقة ل pI ، حيث تفقد شحنتها الصافية.
قبل تشغيل البعد الثاني ، تتم معالجة البروتينات المدمجة باستخدام SDS ، مما يؤدي إلى تغيير طبيعتها وتوفير شحنة سالبة موحدة. بمجرد الانتهاء ، يتم وضع شرائط IPG على هلام بولي أكريلاميد. يجذب المجال الكهربائي المطبق البروتينات نحو الأنود ، حيث تتحرك البروتينات الأكبر بشكل أبطأ عبر الهلام.
بمجرد فصل خليط البروتين وفقا ل pI والوزن الجزيئي ، يتم تصور خريطة البروتين باستخدام البقع ، ويتم تحديد البروتينات ذات الأهمية.
الآن بعد أن ناقشنا مبادئ الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد ، دعنا ننتقل إلى إجراء مختبري نموذجي.
قبل إجراء التجربة ، يجب إذابة البروتينات في الوسائط. يتم إذابة العينة عن طريق إزالة البروتينات المتراكمة بمزيج من العوامل الفوضوية لتعطيل تفاعلات الرابطة الهيدروجينية ، والمنظفات غير الأيونية لمنع تغيير شحنة البروتينات ، وتقليل العوامل لكسر روابط ثاني كبريتيد ، والمخازن المؤقتة. لإزالة البروتينات الوفيرة والجزيئات الأخرى المتداخلة ، يتم استخراج المادة بالتتابع عن طريق الطرد المركزي ، وجمع الحبيبات الناتجة ؛ يليه العلاج بالإندونوكلياز ، وهو إنزيم يستخدم لاستهلاك أي حمض نووي من شأنه أن يتداخل مع التجربة.
بمجرد إذابة البروتينات ، يتم تحضير شرائط IPG عن طريق الشطف بمحلول تنظيف الشريط وتركها رأسا على عقب حتى تجف. ثم يتم تعيين رقم حامل شريطي لكل شريط. بمجرد أن تصبح جاهزة ، يتم تحميل المستخلص الخلوي على الشرائط بحركة بطيئة وانزلاقية من النهاية السلبية إلى النهاية الإيجابية. لغرض الإماهة ، يتم وضع ورق نشاف رطب أعلى القطب الكهربائي وتحت شرائط الهلام ؛ ثم يتم تصطف شرائط IPG على أداة IEF. يتم تطبيق تيار كهربائي عال ، وتبدأ البروتينات في الهجرة.
بعد الانتهاء من البعد الأول ، يتم تحضير جل SDS-PAGE في جهاز الصب. تتم معالجة شرائط IPG عن طريق وضعها ووجهها لأسفل في مخزن مؤقت للتوازن المحتوي على SDS. يتم تجهيز وحدة الرحلان الكهربائي بإضافة المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي. يتم جمع شرائط IPG المعالجة باستخدام ملاقط ، وتوضع فوق ألواح الجل ، وتغلق بمحلول ختم الاغاروز. ثم يطبق مصدر الجهد مجالا كهربائيا ، يتم الاحتفاظ به حتى تكون البروتينات الأسرع حركة على بعد 1 سم من قاع الجل.
بعد الانتهاء من الرحلان الكهربائي ، يجب تصور البروتينات. تقليديا يتم ذلك عن طريق تلطيخ نترات Coomassie الزرقاء أو الفضية. يمكن نقل البروتينات ذات الأهمية من الجل ، وتحليلها عن طريق تحليل اللطخة الغربية.
يتضمن نهج التحديد الثاني استئصال البروتينات من الهلام وهضمها بدلا من تحليلها عن طريق قياس الطيف الكتلي.
الآن بعد أن راجعنا الإجراء ، دعونا نلقي نظرة على بعض استخدامات الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد.
أحد الاستخدامات الأكثر شيوعا لهذه التقنية هو تحديد الجزيئات المشاركة في بدء المرض وتطوره. يمكن للرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد ، إلى جانب قياس الطيف الكتلي ، اكتشاف التنظيم لأعلى أو لأسفل لبروتينات معينة في المناطق المريضة مقارنة بالمناطق السليمة.
بالإضافة إلى ذلك ، يعد الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد مفيدا في متابعة تقدم استجابة المرضى لدواء علاجي محتمل. يمكن أخذ العينات من المرضى في فترات زمنية مختلفة بعد إعطاء العلاج. بهذه الطريقة ، يمكن للرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد إلى جانب اللطخة الغربية أو تحليل الطيف الكتلي ، اكتشاف البروتينات المرتبطة بالاستجابات السلبية مثل الالتهاب. أو عدم وجود البروتينات في حالة تخفيف.
استخدام آخر للرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد هو دراسة بنية البروتين ووظيفته بعد تعديل ما بعد الترجمة ، أو PTM ، وهي إضافات للبروتينات بعد ترجمتها من mRNA. يمكن أن تنظم PTM مجموعة متنوعة من الوظائف ، بما في ذلك إشارات البروتين أو التعبير الجيني أو التسبب في تلف التأكسدة. الرحلان الكهربائي للهلام 2D حساس للتعديلات مثل المثيلة أو الأستلة ، والتي يمكن أن تسبب تحولا في pI وكذلك الوزن الجزيئي.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد. وصف هذا الفيديو مبادئ هذه التقنية ، وهو إجراء تجريبي نموذجي ، والعديد من تطبيقاته في مجال الطب الحيوي.
شكرا للمشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are the two separation methods used in 2D gel electrophoresis?
Two-dimensional gel electrophoresis couples isoelectric focusing (IEF) with SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis). IEF separates proteins in the first dimension based on their isoelectric points, where each protein has a specific pH value with zero net charge. SDS-PAGE then separates proteins in the second dimension by molecular weight, allowing resolution of thousands of proteins from a single mixture.
Q2: How does isoelectric focusing separate proteins in the first dimension?
In isoelectric focusing, proteins are loaded onto immobilized pH gradient (IPG) strips containing ampholytes, molecules with both acidic and basic groups. An electric field is applied, causing proteins to migrate until they reach the pH matching their isoelectric point (pI), where their net charge becomes zero and they stop moving. This precise separation by charge allows proteins with different pI values to be resolved.
Q3: Why is sample solubilization necessary before 2D gel electrophoresis?
Sample solubilization de-aggregates proteins using chaotropic agents to disrupt hydrogen bonds, nonionic detergents to preserve protein charge, and reducing agents to break disulfide bonds. This preparation also includes treatment with endonuclease to remove interfering DNA. Proper solubilization ensures proteins are fully dispersed and ready for separation without interference from other cellular components.
Q4: What happens to proteins during the SDS-PAGE second dimension?
After IEF, IPG strips are treated with SDS-containing equilibration buffer, which denatures proteins and provides them with a uniform negative charge. The strips are then placed on polyacrylamide gels, and an electric field draws proteins toward the anode. Larger proteins move more slowly through the gel matrix, allowing separation by molecular weight and creating a two-dimensional separation pattern.
Q5: How are proteins visualized and identified after 2D gel electrophoresis?
After electrophoresis, proteins are visualized using stains such as Coomassie blue or silver nitrate, creating a proteome map. Proteins of interest can then be identified through Western blot analysis or by excision from the gel, digestion, and analysis by tandem mass spectrometry principle instrumentation uses to determine protein identity and modifications.
Q6: What biomedical applications does 2D gel electrophoresis have?
2D gel electrophoresis is used to identify molecules involved in disease initiation and progression by detecting protein up- or down-regulation in diseased versus healthy areas. It also monitors patient response to therapeutic drugs by detecting inflammation-associated proteins or their absence in treated states. Additionally, it studies protein structure and function following posttranslational modifications like methylation or acetylation, which shift isoelectric point and molecular weight.
Q7: Why can't SDS-PAGE alone fully separate complex protein mixtures?
SDS-PAGE separates proteins only by molecular weight, which means proteins of similar size but different charges cannot be distinguished. Many complex mixtures contain numerous proteins with overlapping molecular weights, making complete separation impossible with a single dimension. Coupling SDS-PAGE with isoelectric focusing in 2D gel electrophoresis adds a second separation axis based on charge, enabling resolution of potentially all proteins in a cell lysate.