Name: جيل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: تعلم عزل الخلايا الكيراتينية البشرية الأساسية من جلد البالغين لدراسة أحياء الجلد في المختبر. تُستخدم هذه التقنية كنموذج لاستكشاف أمراض الجلد الالتهابية وآليات التمايز الخلوي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

المؤلف يود أن يشكر أنيت بلاك راسموسن ومولر كريستين على دعمها التقني

جمع عينات الجلد من المتطوعين البالغين صحية خضوعه لجراحة التجميل يتطلب موافقة من اللجنة الأخلاقية في المؤسسات المضيفة. وأقر هذا البروتوكول الإقليمية الأخلاقية اللجنة من منطقة Midtjylland، الدانمرك (M-20110027). الأسلوب الموصوفة هنا هي المستمدة من دراسات مماثلة من ماسياق et al. ليو وكاراسيك11و 10 .
1-عزل الخلايا الكيراتينيه من جلد الإنسان
<ol>
	<li>ابدأ بتقديم الحلول التالية: حل 50 مل من 0.25% جلوكوز التربسين و 0.1 في المائة في دببس. ميكس وتصفية تعقيم (0.2 ميكرومتر) الحل. إعداد 10 مل ربمي-1640 + 2% FBS الحل، 50 مل من دببس و keratinocyte خالية من المصل المتوسطة (كسفم). إضافة ملاحق كسفم و 250 ميليلتر مع الجنتامايسين إلى 500 مل كسفم. قبل الحارة الحلول إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.</li>
	<li>جمع الجلد من المتطوعين البالغين صحية خضوعه لجراحة التجميل. عينات الجلد المستخدمة هي حوالي 10 سم × 15 سم، ولكن يمكن أن تختلف في الحجم. الحفاظ على الجلد باردة تحت بند النقل بنقل عينات الجلد في مربع الستايروفوم التي تحتوي على عنصر تبريد. إذا لزم الأمر، يمكن تخزين العينة الجلد عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.</li>
	<li>إزالة الدهون من أسفل المقطع الجلد باستخدام مقص معقم والمشارط، وملقط.</li>
	<li>مشبك بالمقطع الجلد (حوالي 10 × 15 سم) على غلاف عقيمة على رأس لوحة باستخدام الإبر. أولاً، قم بتنظيف الجلد بوسادة شاش معقم جاف. ثم قم بتنظيف الجلد باستخدام وسادة شاش معقم مع الإيثانول 70%.</li>
	<li>استخدام استواء سيرا على أقدام، قطع من الطبقة العليا (البشرة) قسم الجلد ووضعها في سم 9 طبق بيتري. ثم فورا إضافة 25 مل الحل دببس/التربسين/الجلوكوز (إعداد في الخطوة 1، 1) إلى طبق بيتري. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>استخدام ماصة إزالة الحل دببس/التربسين/الجلوكوز من طبق بيتري وإضافة 10 مل من RPMI 1640 + 2% FBS لإلغاء تنشيط التربسين.</li>
	<li>استخدام الملقط اثنين، الآن إطلاق خلايا البشرة في المتوسط بلطف كشط والتحريض البشرة والمقصورة الجلد من أقسام الجلد.</li>
	<li>تصفية تعليق خلية البشرة من خلال عامل تصفية معادن (حجم فجوة 1 ملم)، وجمع في أنبوب 50 مل. إضافة المقاطع الجلد المتبقية إلى أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل 1640 RPMI دون FBS ودوامه لتصفية س. 10 التعليق من خلال المعدن تصفية في أنبوب 50 مل الذي يحتوي على تعليق خلية البشرة. إضافة دببس إلى إجمالي حجم 50 مل.</li>
	<li>الطرد المركزي بتعليق خلية لمدة 10 دقيقة في 450 x ز في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه خلية البشرة في حوالي 10 مل من 37 درجة مئوية كسفم تبعاً لحجم الخلية بيليه. عد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق تلطيخ الأسلوب تحت المجهر. عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من قسم جلد 10 × 15 سم من حوالي 50-100 × 106 خلايا. لكل قارورة الثقافة2 75 سم، نقل 8 × 106 خلايا جنبا إلى جنب مع 12 مل 37 درجة مئوية كسفم. بلطف يهز قوارير الثقافة لضمان التوزيع الموحد للخلايا.</li>
	<li>احتضان الخلايا الكيراتينيه في حاضنة 37 درجة مئوية مع 100% رطوبة و 5% CO2. تغيير في المتوسط بعد يومين وثلاث مرات أسبوعيا. مرور الخلايا عند الثقافة روافد 70-80 ٪، التي تستغرق حوالي 2 أسابيع تبعاً لمعدل انتشار الخلايا الكيراتينيه.</li>
</ol>
2-باساجينج من الخلايا الكيراتينيه
<ol>
	<li>الحرارة المبلغ المناسب لحل يدتا التربسين 0.05% إلى 37 درجة مئوية في حاضنة. استخدام 4.5 مل من محلول يدتا التربسين 0.05% قارورة ثقافة2 75 سم.</li>
	<li>إزالة المتوسطة من الخلايا، وإضافة 4.5 مل/75 سم2 الثقافة قارورة استعد قبل حل يدتا التربسين 0.05% للخلايا. ضع قارورة الثقافة في الحاضنة (37 درجة مئوية) وبعد حوالي 5 دقائق، تحقق تحت المجهر إذا كانت الخلايا قد بدأ تفكك.</li>
	<li>عندما قد خففت حوالي 50% الخلايا، بلطف ضرب قارورة الثقافة ضد اليد لتخفيف الخلايا المتبقية. لإلغاء تنشيط التربسين، إضافة 6 مل ربمي-1640 + 2% FBS (37 درجة مئوية) إلى قارورة الثقافة2 75 سم ثم نقل تعليق خلية لأنابيب 50 مل.</li>
	<li>شطف قوارير الثقافة مع 3 مل من RPMI 1640 + 2% FBS وإضافة إلى أنابيب 50 مل. الطرد المركزي خلايا لمدة 10 دقيقة في 450 x ز في درجة حرارة الغرفة.
	<ol>
		<li>ريسوسبيند الخلايا الأعلاف في 10 مل كسفم (37 درجة مئوية). عد الخلايا ونقل 3 × 106 خلايا 150 سم2 ثقافة قارورة جنبا إلى جنب مع 20 مل كسفم (37 درجة مئوية). بلطف يهز قارورة الثقافة لضمان التوزيع الموحد للخلايا. تجميد الخلايا عند الثقافة روافد 80-90 ٪، الذي يستغرق حوالي 4-6 أيام تبعاً لمعدل انتشار الخلايا الكيراتينيه (انظر القسم 3، تجميد البروتوكول أدناه). توسيع نطاق الخلايا الكيراتينيه لتوليد الأرصدة المجمدة المناسبة.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3-تجميد الخلايا الكيراتينيه
<ol>
	<li>الحرارة المبلغ المناسب لحل يدتا التربسين 0.05% إلى 37 درجة مئوية في حاضنة. استخدام 9 مل من محلول يدتا التربسين 0.05% 150 سم2 ثقافة قارورة.</li>
	<li>إزالة المتوسطة من الخلايا، وإضافة2 مل 9/150 سم الثقافة قارورة استعد قبل 0.05% يدتا التربسين حل للخلايا. ضع قارورة الثقافة في الحاضنة (37 درجة مئوية) وبعد حوالي 5 دقائق، تحقق تحت المجهر إذا كانت الخلايا قد بدأ تفكك.</li>
	<li>عندما قد خففت حوالي 50% الخلايا، بلطف ضرب قارورة الثقافة ضد اليد من أجل تخفيف الخلايا المتبقية. لإلغاء تنشيط التربسين، إضافة 12 مل ربمي-1640 + 2% FBS (37 درجة مئوية) إلى قارورة الثقافة2 150 سم ثم نضح تعليق خلية لأنابيب 50 مل.</li>
	<li>شطف قوارير الثقافة مع 6 مل من RPMI 1640 + 2% FBS وإضافة إلى أنابيب 50 مل. الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 10 دقيقة في 450 غ س في 4 درجات مئوية. تعد الخلية المثلج تجميد المتوسطة (كسفم + 10% [دمس]).</li>
	<li>ريسوسبيند بيليه الخلية في كسفم + 10% [دمس]، عد الخلايا، وتجميد الخلايا في كثافة 6 × 106 خلايا/مل باستخدام أساليب تجميد تجميد بطيء القياسية12.</li>
	<li>تخزين الخلايا الكيراتينيه في النتروجين السائل (مرحلة البخار) حتى جاهزة للاستخدام.</li>
</ol>
4-ذوبان الجليد واستزراع الخلايا الكيراتينيه المجمدة
<ol>
	<li>سرعة ذوبان الجليد القنينات المجمدة المناسبة في حمام مائي 37 درجة مئوية. استخدام الإيثانول 70% لتنظيف الجزء الخارجي من كريوفيال. نقل العدد المناسب من الخلايا (خلايا/سم تقريبا 15,0002) قارورة ثقافة وفورا إضافة النمو قبل حرارة متوسطة (كسفم) إلى قارورة الثقافة. ويمكن استخدام أي حجم من قوارير الثقافة تبعاً للإعداد للتجربة.</li>
	<li>استخدام 5 مل الثقافة المتوسطة قارورة ثقافة 25 سم2 .</li></ol>وأضاف العدد الخلايا قارورة الثقافة قد تختلف نظراً لنمو الخلايا تختلف من مانح إلى. احتضان خلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 100% رطوبة و 5% CO2.
	<li>تغير المتوسط بعد يومين وثلاث مرات أسبوعيا استخدام الطازجة كسفم المعالجون مسبقاً. ملاحظة: البيانات المتوفرة لدينا قد أثبتت أن 95% الخلايا المعزولة ببروتوكول الموصوفة هنا إيجابية بالنسبة لل 14 سيتوكيراتيني keratinocyte ماركر13في المتوسط.</li>

<ol><li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li>
<li>Nickoloff, B. J., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes%3A+key+immunocytes+of+the+integument%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes: key immunocytes of the integument.</a> Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).</li>
<li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li>
<li>Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+immune+system+Its+cellular+constituents+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">The skin immune system Its cellular constituents and their interactions.</a> Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).</li>
<li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).</li>
<li>Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+in+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets+Inflamm+Allergy%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes in inflammatory skin diseases.</a> Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).</li>
<li>Gilliet, M., Lande, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+and+self-DNA+in+autoimmune+skin+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation.</a> Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).</li>
<li>Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+inhibits+ERK-mediated+collagenase-1+%28MMP-1%29+expression+in+collagen-activated+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).</li>
<li>Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+IL-33+expression+by+IFN-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+in+normal+human+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).</li>
<li>Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+endocrine+approach+to+the+control+of+epidermal+growth%3A+serum-free+cultivation+of+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes.</a> Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).</li>
<li>Liu, S. C., Karasek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+growth+of+adult+human+epidermal+keratinocytes+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.</a> J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).</li>
<li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).</li>
<li>Otkjaer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-20+gene+expression+is+induced+by+IL-1beta+through+mitogen-activated+protein+kinase+and+NF-kappaB-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms.</a> J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).</li>
<li>Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involucrin+and+other+markers+of+keratinocyte+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).</li>
<li>Boyce, S. T., Ham, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+differentiation+of+normal+human+epidermal+keratinocytes+in+chemically+defined+clonal+culture+and+serum-free+serial+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).</li>
<li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+models+of+normal+and+diseased+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19 Unit 19.19 (2008).</li>
<li>Kamsteeg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+helper+T-cell+cytokines+induce+morphologic+and+molecular+characteristics+of+atopic+dermatitis+in+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent.</a> Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).</li>
<li>van den Bogaard, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment%3A+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li>
<li>Raaby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langerhans+cell+markers+CD1a+and+CD207+are+the+most+rapidly+responding+genes+in+lesional+psoriatic+skin+following+adalimumab+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment.</a> Exp Dermatol. , (2017).</li>
</ol>

. وقد صاحب البلاغ لا تضارب في المصالح.

هنا، نحن تصف كيفية عزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار بسهولة، وكيف أن الثقافة لهم في المختبر. هذا النموذج يمكن أن يكون أحد تطبيقات واسعة للتحقيق في بيولوجيا الخلايا البشرة، ويمكن أن يكون مفيداً للباحثين المهتمين بدراسة الأمراض الجلدية.
بعض المزايا للبروتوكول هو موضح هنا على النقيض من الخلايا الكيراتينيه معزولة عن الولدان القلفة التي تم الحصول عليها من الذكور حديثي الولادة تمر بالختان، الكيراتينيه البشرية الأولية من المرضى البالغين معزولة من الرجال والنساء على حد ...

الجلد هو أكبر جهاز في جسم الإنسان، ويعمل كحاجز وقائي ضد البيئة الخارجية. ويتألف الجلد من طبقتين الرئيسية: الأدمة والبشرة، حيث يشكل البشرة الطبقة الخارجية من الجلد. نوع الخلية الأكثر وفرة في البشرة من الخلايا الكيراتينيه تتألف من أكثر من 95% من الخلية الجماعية1،2. يتم الاحتفاظ بمراحل مختلفة من التمايز في البشرة الخلايا الكيراتينيه ويتم تنظيمها في الطبقات القاعدية والشائكة والحبيبية، وكورنيفيد التي تتوافق مع مراحل محددة من التمايز3. الوظيفة الأساسية للخلايا الكيراتينيه لتوفير السلامة الهيكلية للبشرة، وبالتالي إنتاج حاجز سليمة للعالم الخارجي.
الخلايا الكيراتينيه أيضا تمثل الخط الأول للدفاع ضد العوامل الممرضة في الجلد، وذلك دوراً هاما في الاستجابة المناعية الفطرية4،5. تعرض الخلايا الكيراتينيه للمنبهات الخارجية يؤدي إلى تفعيل مسارات الإشارات داخل الخلايا، وفي وقت لاحق، إنتاج عدد من الوسطاء التهابات مختلفة بما في ذلك السيتوكينات والمستقطبات الببتيدات المضادة للميكروبات. هذه البروتينات المشتقة من keratinocyte المشاركة في الاستجابة الالتهابية عن طريق تجنيد وتفعيل الخلايا المناعية مثل الخلايا الجذعية، العَدلات، وخلايا T محددة6،7. وهكذا، لأن الخلايا الكيراتينيه تلعب دوراً حاسما في العديد من العمليات البيولوجية، كان الأساس المنطقي لهذه التقنية المقدمة هنا لإنشاء نموذج في المختبر لدراسة البيولوجيا الجلد. كثيرا ما تستخدم الثقافات keratinocyte الأولية التي تم الحصول عليها من حديثي الولادة القلفة لدراسة البيولوجيا الجلد8،9. ومع ذلك، مع الأسلوب الموصوفة هنا، الكيراتينيه من كلا الجنسين يتم الحصول عليها أدى تنوع البيولوجي أعلى من الخلايا.
نقدم هنا، بروتوكول مفصل لعزله وجيل من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار، بما في ذلك الصيانة وتجميد الخلايا الكيراتينيه. والهدف العام لهذا الأسلوب هو توليد الكيراتينيه البشرية الأساسية التي يمكن استخدامها كنموذج لدراسة البيولوجيا الجلدي في المختبر.

<table><tbody><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>مكملات زراعة الخلايا المتوسطة</td></tr><tr><td>KSFM مكملات</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>ل KSFM</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td>DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>D8418</td><td>ثنائي ميثيل سلفوكسيد</td></tr><tr><td>جنتاميسين</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td>ثقافة الخلية مرشح التعقيم المضاف المتوسط</td></tr><tr><td></td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>مرشح حقنة بحجم مسام 0.2 وميكرو ؛ م</td></tr><tr><td>التربسين</td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>T7409</td><td>يستخدم لتربسين الخلايا</td></tr><tr><td>الجلوكوز</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>G7528-RPMI-1640</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010-FBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16000044</td><td>يستخدم لتعطيل ملقط التربسين</td></tr> <tr><td></td><td>-</td><td></td> يمكن <td>استخدام</td></tr> <tr>الملقط من أي شركة<td>مقص</td> <td>-</td><td></td> <td>يمكن استخدام مقص من أي شركة</td></tr><tr><td>يمكن استخدام مشرط</td><td>سوان مورتون</td><td>0501</td><td>من أي شركة</td></tr><tr><td>70٪ إيثانول</td> <td>-</td><td>--</td><td></td></tr> <tr><td>يمكن استخدام وسادات الشاش</td><td>NOBAMED</td><td>875420</td><td>وسادات الشاش من أي مزود</td></tr><tr><td>يمكن استخدام</td><td></td><td></td><td></td> مسوي القدم Credo Solingen 1510 Foot مسوي من أي مزود</tr><tr><td>يمكن استخدام أطباق بتري</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>أطباق بتري من أي مزود</td></tr><tr><td>فلتر معدني</td> <td>-</td><td></td> <td>فلتر معدني بحجم 1 مم بحجم</td></tr><tr><td>ثقب 75 سم < سوب > 2 < / سوپ > قوارير ثقافة</td><td>NUNC</td> <td>156499-150</td><td></td></tr> <tr><td>سم < سوب > 2 < / سوپ > قوارير ثقافة</td><td>TTP</td><td>90151-0.05</td><td></td></tr><tr><td>٪ محلول تريبسين EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td>يستخدم لتربسين الخلايا عند المرور</td></tr></tbody></table>

جيل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

والوظيفة الرئيسية للخلايا الكيراتينيه توفير السلامة الهيكلية للبشرة، وبالتالي الحفاظ على حاجز ميكانيكية على العالم الخارجي. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا الكيراتينيه تلعب دوراً أساسيا في البدء، والصيانة، وتنظيم الاستجابات المناعية البشرة بكونها جزءا من نظام المناعة الفطرية الاستجابة للمحفزات مستضدي بطريقة سريعة وغير محدد. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار، وتبين أن هذه الخلايا تستجيب للتمايز المحطة الطرفية المستحثة بالكالسيوم، الذي يقاس بتعبير زيادة من إينفولوكرين علامة تمييز. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تبين أن الخلايا الكيراتينيه معزولة تستجيب لتفعيل مسارات الإشارات داخل الخلايا التي يسببها 1β إيل مقاسا بتنشيط p38 MAPK المسار. أخذت معا، يصف لنا طريقة للعزل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار. لأن الخلايا الكيراتينيه نوع الخلية الغالبة في البشرة، يعد هذا الأسلوب مفيداً لدراسة الآليات الجزيئية في البيولوجيا الجلدي في المختبر.

تمايز المحطة الطرفية المستحثة بالكالسيوم الكيراتينيه البشرية تخضع للتمايز المحطة الطرفية عند المعاملة بالكالسيوم14،،من1516. الكيراتينيه البشرية الأولية كانت معزولة ومثقف كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. عندما حفز الخلايا مع الكالسيوم (1.2 مم) حوالي 50-60% روافد، أو أخذت السيارة وصور للخلايا في اليوم 0 و 1 و 2. ويبين الشكل 1 التغيرات المورفولوجية للخلايا الكيراتينيه ولاحظ عند تنشي...

جلد الإنسان يعمل كخط أول للدفاع ضد البيئة الخارجية. نحن نقدم طريقة لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار. هذه الخلايا الكيراتينيه معزولة هي مفيدة في الأجهزة التجريبية العديدة، وهي نموذج مناسب جداً لدراسة الآليات الجزيئية في البيولوجيا الجلدي في المختبر.

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد الخلايا الكيراتينية البشرية الأولية التي يمكن استخدامها كنموذج لدراسة البيولوجيا الجلدية في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا خلايا البشرة ، مثل كيفية تنظيم تمايز الخلايا الكيراتينية البشرية أو كنموذج لدراسة الأمراض الجلدية الالتهابية. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنه يمكن عزل الخلايا الكيراتينية البشرية الأولية تقليديا عن جلد البالغين لكل من الرجال والنساء ويمكن أن تشمل الجلد من الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 18 عاما.ستظهر الإجراء أنيت بلاك راسموسن ، فنية من مختبري. للبدء ، قم بإعداد محلول 50 مل من 0.25٪ تريبسين و 0.1٪ جلوكوز في DPBS. ثم امزج وقم بتصفية تعقيم المحلول.تحضير 10 ملليلتر من RPMI 1640 بالإضافة إلى 2٪ FBS ، و 50 مل من DPBS ووسط مصل خالية من الخلايا الكيراتينية ، أو KSFM. أضف مكملات KSFM و 250 ميكرولتر من الجنتاميسين إلى 500 مل من KSFM. ثم قم بتسخين المحاليل مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.اجمع عينات جلدية 10 سم × 15 سم من المتطوعين البالغين الأصحاء الذين يخضعون لجراحة تجميلية. حافظ على برودة الجلد عن طريق نقل عينات الجلد في صندوق من الستايروفوم يحتوي على عنصر تبريد. إذا لزم الأمر ، قم بتخزين عينة الجلد عند أربع درجات مئوية طوال الليل.باستخدام مقص ومشارط وملقط معقم ، قم بإزالة الدهون من أسفل قسم الجلد. ثم ، باستخدام الإبر ، اربط قسم الجلد على غطاء معقم أعلى لوحة. باستخدام وسادة شاش جافة ومعقمة ، نظف الجلد.ثم اتبعه بنسبة 70٪ من الإيثانول على وسادة شاش معقمة. بعد ذلك ، باستخدام مسوي القدم ، قم بقطع طبقة البشرة العليا من قسم الجلد ونقلها إلى طبق بتري بطول تسعة سنتيمترات. بعد ذلك ، أضف على الفور 25 مل من محلول الجلوكوز DPBS التربسين المعد مسبقا إلى طبق بتري.احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. باستخدام ماصة، قم بإزالة محلول جلوكوز التربسين DPBS من طبق بتري وأضف 10 ملليلتر من RPMI 1640 بالإضافة إلى 2٪ FBS لتعطيل التربسين. الآن ، باستخدام ملقطين ، حرر خلايا البشرة في الوسط عن طريق كشط وتحريك كل من البشرة والحيز الجلدي لأقسام الجلد برفق.قم بتصفية تعليق خلية البشرة من خلال مرشح معدني واجمع المرشح في أنبوب سعة 50 مل. أضف أقسام الجلد المتبقية إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على 10 مل من RPMI 1640 بدون FBS والدوامة لمدة 10 ثوان. قم بتصفية هذا التعليق من خلال المرشح المعدني إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على تعليق خلايا البشرة.ثم أضف DPBS إلى الحجم الإجمالي البالغ 50 ملليلترا. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 450 مرة G ودرجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم, قم بإزالة المادة الطافية واعتمادا على حجم حبيبات الخلية, أعد تعليق حبيبات خلية البشرة في حوالي 10 ملليلتر من 37 درجة مئوية KSFM.باستخدام طريقة تلطيخ التريبان الأزرق ، عد الخلايا تحت المجهر. بعد ذلك ، إلى كل قارورة ثقافة 75 سم مربع ، انقل ثمانية مرات 10 إلى الخلايا السادسة ، جنبا إلى جنب مع 12 مل من 37 درجة مئوية KSFM. رج قوارير الثقافة برفق لضمان التوزيع المنتظم للخلايا.احتضان الخلايا الكيراتينية في حاضنة 37 درجة مئوية مع رطوبة 100٪ و 5٪ CO2. قم بتغيير الوسط بعد يومين ثم ثلاث مرات أسبوعيا. عندما تصل الخلايا إلى 70-80٪ من التقاء ، احتفظ بالكمية المناسبة من محلول التربسين EDTA بنسبة 0.05٪ إلى 37 درجة مئوية في حاضنة.قم بإزالة الوسط من الخلايا وأضف 4.5 مل لكل 75 سم مربع قارورة مزرعة من محلول EDTA 0.05٪ التربسين الدافئ مسبقا إلى الخلايا. بعد وضع قارورة الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تقريبا ، تحقق تحت المجهر مما إذا كانت الخلايا قد بدأت في الارتخاء. عندما يتم تخفيف ما يقرب من 50٪ من الخلايا ، اضرب قارورة المزرعة برفق على اليد لفك الخلايا المتبقية.بعد ذلك ، لتعطيل التربسين ، أضف ستة ملليلتر من 37 درجة مئوية RPMI 1640 بالإضافة إلى 2٪ FBS إلى قارورة الثقافة التي تبلغ مساحتها 75 سم مربع وانقل تعليق الخلية إلى أنابيب 50 ملليلترا. اشطف قوارير الاستزراع بثلاثة ملليلتر من RPMI 1640 بالإضافة إلى 2٪ FBS وأضف الوسط إلى أنابيب 50 ملليلترا. ثم قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة 10 دقائق عند 450 مرة G ودرجة حرارة الغرفة.استخدم 10 ملليلتر من 37 درجة مئوية KSFM لإعادة تعليق الخلايا المحببة. بعد ذلك ، عد وانقل ثلاث مرات 10 إلى الخلايا السادسة إلى قارورة مزرعة مساحتها 150 سم مربع ، جنبا إلى جنب مع 20 مل من 37 درجة مئوية KSFM. رج قارورة الثقافة برفق لضمان التوزيع المنتظم للخلايا ، قبل إعادة الخلايا إلى الحاضنة.عندما تكون الثقافة ملتقية بنسبة 80-90٪ ، بعد التربسين ونقل الخلايا إلى أنابيب سعة 50 مليلتر ، كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو ، اشطف قوارير الثقافة بستة ملليلتر من RPMI 1640 بالإضافة إلى 2٪ FBS وأضفها إلى أنابيب 50 ملليلترا. الطرد المركزي للأنابيب لمدة 10 دقائق عند 450 مرة جم وأربع درجات مئوية. ثم قم بإعداد وسط تجميد الخلايا الباردة.أعد تعليق حبيبات الخلية في KSFM بالإضافة إلى 10٪ DMSO. بعد ذلك ، بعد عد الخلايا ، قم بتجميدها بكثافة ستة أضعاف 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر ، باستخدام طرق الحفظ بالتبريد القياسية بطيئة التجميد. قم بتخزين الخلايا الكيراتينية في النيتروجين السائل حتى تصبح جاهزة للاستخدام.كما هو موضح هنا ، تم عزل الخلايا الكيراتينية البشرية وزراعتها ، كما هو موضح في هذا الفيديو ثم تحفيزها بالكالسيوم. تظهر هذه الصور التغيرات المورفولوجية الناتجة عن إضافة الكالسيوم في اليومين الأول والثاني ، مقارنة بالخلايا المعالجة الخاضعة للرقابة. بالإضافة إلى التغيرات المورفولوجية ، أدت إضافة الكالسيوم أيضا إلى زيادة في نسخ الرنا المرسال لعلامة التمايز Involucrin ، 5.5 أضعاف بعد 24 ساعة و 3.5 أضعاف بعد 48 ساعة.في هذه التجربة ، تم تحفيز الخلايا الكيراتينية المستنبتة باستخدام IL-1 beta لفترات زمنية مختلفة. كما يتضح من النشاف الغربي ، في غضون خمس دقائق ، أدى تحفيز بيتا IL-1 إلى فسفرة تنشيط سريع لكيناز p38 MAP حيث لم يكن لتحفيز بيتا IL-1 أي تأثير على مستويات البروتين الإجمالية ل p38 MAP kinas. بعد ساعة واحدة ، عادت فسفرة كيناز p38 MAP المستحثة ل IL-1 إلى المستويات القاعدية.بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا خلايا البشرة البشرية لاستكشاف دور الخلايا الكيراتينية في الاستجابات المناعية الفطرية ، وكذلك في نمو الجلد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل واستزراع الخلايا الكيراتينية الأولية من جلد الإنسان البالغ ، والتي يمكن استخدامها كنموذج لدراسة بيولوجيا الجلد في المختبر.

generation-culturing-primary-human-keratinocytes-from-adult

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

علم الأحياء النمائي

ووصف سريع ، طريقة سليمة قابلة للاستمرار في عزل الخلايا الجذعية البالغة الظهارية من الجلد البشري. الأسلوب يستخدم الهضم الأنزيمي مصفوفة الكولاجين الجلد ، تليها نتف من بصيلات الشعر وعزلة تعليق خلية واحدة أو شظايا الأنسجة للثقافة الخلية.

العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية الظهارية من الجلد البشري

يصف هذا الفيديو عزل الخلايا الكيراتينية - أبرز خلايا طبقة البشرة في جلد الإنسان ، من خلال استخدام مزيج من طرق الهضم الأنزيمي والتعطيل الميكانيكي. تساعد هذه الطريقة في النمو التفضيلي للخلايا الكيراتينية على أنواع خلايا الجلد الأخرى باستخدام وسط نمو انتقائي.

عزل الخلايا الكيراتينية في جلد الإنسان: طريقة لزراعة الخلايا الكيراتينية الأولية من عينات الجلد

يصف هذا الفيديو بروتوكولا مفصلا لإنتاج الخلايا الكيراتينية البشرية الأولية المعدلة وراثيا الفيروس القهقري المؤتلف. يمكن استخدام هذه الطريقة لمعالجة التعبير الجيني في الخلايا الكيراتينية.

التعديل الجيني للخلايا الكيراتينية البشرية الأولية: طريقة للتلاعب الوراثي بالخلايا الكيراتينية باستخدام الفيروسات القهقرية المؤتلفة

توفر هذه المخطوطة إجراء خطوة بخطوة لاشتقاق الخلايا الكيراتينية البشرية وصيانتها من الشعر المقطوع والجيل اللاحق من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان الخالية من التكامل (hiPSCs) بواسطة النواقل العرضية.

جيل من التكامل خالية الإنسان المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية عن طريق الشعر المستمدة من الخلايا الكيراتينية

الهدف من هذه الورقة هو توفير بروتوكول شامل ومفصل حول كيفية توليد جلد عضوي بشري معدل وراثيا من الخلايا الكيراتينية للبشرة والأدمة البشرية الزاولة للحيوية.

جيل المعدلة وراثيا الثقافات الجلد الميتة عضوي عن طريق الأدمة الإنسان

تشكل الخلايا الكيراتينية البشرة حاجز الجلد وظيفية ويتم وضعها في الخط الأمامي للدفاع المضيف ضد الشتائم البيئية الخارجية. هنا نحن تصف أساليب العزلة والثقافة الأولية من الخلايا الكيراتينية البشرة من حديثي الولادة والجلد الماوس الكبار، وتحريض من التمايز الطرفية والاستجابة الالتهابية أوفب أثارت من الخلايا الكيراتينية.

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

نقدم هنا بروتوكولا لكفاءة عزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية من أنسجة الجلد الكبار. يبسط هذا الأسلوب الإجراء التقليدي باستخدام Y-27632 مثبط لموسيقى الروك في الأجلين المتوسط والتطعيم بصورة عفوية فصل خلايا البشرة من خلايا الجلد.

أسلوب مبسط وفعال لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية من أنسجة الجلد الكبار

يصف هذا البروتوكول طريقة مباشرة لزراعة البشرة البشرية ثلاثية الأبعاد المعاد تشكيلها بطريقة قابلة للاستنساخ وقوية. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يميز العلاقة بين هيكل وظيفة من نموذج حاجز البشرة. كما يتم تقديم الاستجابات البيولوجية للبشر المعاد تشكيلها على المحفزات النهمة.

زراعة بشرة بشرية ثلاثية الأبعاد أعيد بناؤها على نطاق واسع

هنا نحن نصف بروتوكول للزراعة المنهجية للشفرات البشرة في ثقافة التعليق ثلاثي الأبعاد. هذا البروتوكول له تطبيقات واسعة النطاق للاستخدام في مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة الظهارية ولنمذجة العديد من الأمراض والحالات البشرية.

إنشاء نظام ثقافة البشرة عالية الإنتاجية لنمذجة اللدونة الخلايا الجذعية Keratinocyte

يصف هذا البروتوكول عزلة وثقافة الخلايا القرنية الفموية المشتقة من الحنك الفأري البالغ. كما يتم الإبلاغ عن طريقة تقييم تستخدم التثبيط المناعي.

عزل وثقافة الكريات الكيراتينية الفموية الأولية من الحنك الفأري البالغ

يحدد هذا البروتوكول ثقافة الخلايا الكيراتينية التي تم الحصول عليها حديثا (المقطع 0) لاستخدامها في تصوير الخلايا الحية.

توليد الثقافات الأولية لتصوير الخلايا الحية للخلايا الكيراتينية

تعلم عزل الخلايا الكيراتينية البشرية الأساسية من جلد البالغين لدراسة أحياء الجلد في المختبر. تُستخدم هذه التقنية كنموذج لاستكشاف أمراض الجلد الالتهابية وآليات التمايز الخلوي.

جيل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار

استكشف المزيد من الفيديوهات