إنتاجية عالية، وتحديد محتوى البروتين المحددة في مستويات الأنسجة باستخدام نقطة الكمية المطلقة لطخة تحليل (قدب)
أغسطس 21, 2018
هنا نظهر عملية مفصلة للتحليل الكمي دوت وصمة عار (قدب) بتحديد مضمون مطلق من البروتين المستهدف، وضع سقف لبروتين الأكتين، مثل جيلسولين (كابج)، في ثلاث ماوس مختلف الأنسجة. علينا أن نظهر بإنتاجية عالية، وتقنية إيمونوبلوت مريحة، والكمية للتحقق من صحة العلامات البيولوجية على مستوى الخلايا والأنسجة و.
يمكن تسمية هذه الطريقة ب ELISA على مستوى الأنسجة لإبعاد نفسها عن القياس الكمي النسبي شبه الكمي التقليدي لمحتوى البروتين على المستويات الخلوية والأنسجة وهو المعيار في مختبر الأبحاث وفي مجال التشخيص السريري حاليا. يمكن وصف المزايا الرئيسية لهذه التقنية بثلاث كلمات ، عالية الإنتاجية ، كمية ، ومطلقة. إذا أضفنا كلمة أخرى ، فسيكون الأمر بسيطا.
تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى مجال البروتينات بينما يمكن التحقق من المؤشرات الحيوية بتنسيق عالي الإنتاجية. هذه الطريقة لها تطبيقات واسعة في جميع أنحاء البحث والمجال السريري. لا يزال القياس الكمي لكمية البروتين على مستويات الخلايا والأنسجة بدائيا في الوقت الحاضر.
بشكل عام ، لن يواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة أي مشكلة في تعلم هذه التقنية وهي أساسية للغاية وتتطلب الحد الأدنى من المهارات المعملية لأدائها. نحن متحمسون لإثبات موثوقيتها وبساطتها ودقتها في هذه التقنية باستخدام النموذج الحيواني. يمكن تحضير العينات بأي طريقة تقليدية لتحضير العينة باستخدام أي مخازن تحلل شائعة الاستخدام في مختبر الأبحاث مع أو بدون منظف مثل MP40 أو Triton X.In حالتنا ، نستخدم مخزن تحلل Triton X.
ضع شريحة من الأنسجة من خمسة إلى 100 ملليغرام في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من محلول التحلل المكمل بمثبطات البروتياز والفوسفاتيز. بعد ذلك ، قم بتجانس الأنسجة باستخدام الخالط لمدة دقيقة واحدة على الجليد.
ثم قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 10 دقائق عند 8,000 مرة جم عند أربع درجات مئوية. اجمع المادة الطافية في أنابيب جديدة وأخرج ميكرولتر واحدا لقياس كمية البروتين الإجمالية في محللة البروتين باستخدام مجموعة أدوات تحديد البروتين مثل مقايسة BCA. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ثم قم بقياس الامتصاص عند 562 نانومتر على قارئ صفيحة دقيقة.
في هذه الخطوة ، باستخدام بروتين مؤتلف بتركيز معروف كمعيار ، قم بتخفيف البروتين إلى تركيز 12،000 بيكوغرام لكل ميكرولتر كمحلول مخزون. وفي الوقت نفسه ، قم بتخفيف محللات العينة المحضرة إلى أربعة ميكروغرام لكل ميكرولتر. لتحقيق نتائج أكثر موثوقية ، نوصي باستخدام مزيج من عينات المحللة لتجنب أي اختلاف بين العينات الفردية.
قم بتخفيف كل من البروتين القياسي والعينات المحضرة بشكل متسلسل لدراسة الجرعة النموذجية. تم استكمال BSA لضمان كميات متساوية تقريبا من البروتين المحمل لكل عينة. بعد ذلك ، امزج 10 ميكرولترات من البروتين القياسي المخفف بشكل متسلسل أو محللات العينة مع 10 ميكرولتر من مخزن التحميل 2X.
ثم سخني الخليط على حرارة 85 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. في هذا الإجراء، ضع صندوقا فارغا لطرف الماصة أسفل لوحة QDB لتجنب ملامسة الجزء السفلي من اللوحة لسطح الطاولة. قم بتحميل ما يصل إلى ميكرولترين من العينة إلى مركز الغشاء في الجزء السفلي من وحدة فردية من لوحة QDB.
لا تسمح أبدا للجزء السفلي من لوحة QDB بملامسة أي سطح أثناء التحميل ولا تقم بتحميل الكثير للبئر الفردي. في تجربتنا ، لا يزيد عن أربعة ميكرولتر لكل بئر. بعد ذلك ، اترك لوحة QDB المحملة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو اترك المحملة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في مكان جيد التهوية.
لسد اللوحة ، اغمس لوحة QDB في مخزن النقل ورجها برفق لمدة 10 ثوان. بعد ذلك ، اشطف لوحة QDB برفق باستخدام TBST ثلاث مرات ثم اغسل الطبق لمدة خمس دقائق في TBST تحت الاهتزاز المستمر. بعد ذلك ، قم بحظر لوحة QDB بمخزن مؤقت للحجب لمدة ساعة واحدة تحت الاهتزاز المستمر.
الآن ، قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي في المخزن المؤقت للحجب بتركيز مختار وأضف 100 ميكرولتر منه إلى كل بئر فردي من صفيحة عادية مكونة من 96 بئرا. أدخل لوحة QDB في اللوحة المكونة من 96 بئرا واحتضان الألواح المدمجة إما لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند أربع درجات مئوية تحت الاهتزاز المستمر. بعد ذلك ، اشطف الطبق برفق باستخدام TBST ثلاث مرات قبل غسله ب TBST ثلاث مرات في كل مرة لمدة خمس دقائق تحت الاهتزاز المستمر.
بعد ذلك ، قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي في المخزن المؤقت المانع بالتركيز المختار وقم بإخراج 100 ميكرولتر في كل بئر من صفيحة 96 بئرا. ثم قم باحتضان لوحة QDB داخل اللوحة المحملة بسعة 96 بئرا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة تحت الاهتزاز المستمر. اشطف طبق QDB برفق ثلاث مرات باستخدام TBST ثم اغسل الطبق ثلاث مرات وخمس دقائق لكل منها باستخدام TBST تحت الرج المستمر.
للقياس الكمي ، قم بإعداد ركيزة ECL وقم بتقسيمها في صفيحة 96 بئرا عند 100 ميكرولتر لكل بئر. ثم أدخل لوحة QDB داخل اللوحة المكونة من 96 بئرا لمدة دقيقتين تحت الاهتزاز المستمر. بعد ذلك ، قم بإزالة لوحة QDB من اللوحة المكونة من 96 بئرا ورجها لفترة وجيزة لإزالة السائل الزائد.
بعد ذلك ، ضع اللوحة على صفيحة ميكروتيتر بيضاء. بعد ذلك ، قم بتشغيل قارئ اللوحة الدقيقة وحدد اللوحة ذات الغطاء على واجهة المستخدم قبل وضع اللوحات المدمجة داخل قارئ اللوحة الدقيقة للقياس الكمي. تأكد من اختيار اللوحة ذات الغطاء لتجنب الأخطاء.
يوضح هذا الشكل خصوصية الأجسام المضادة للأرانب المضادة ل CAPG باستخدام محللات أنسجة الفئران المحضرة من الطحال والقلب والعضلات والكلى والكبد والبروستاتا مع تحليل اللطخة الغربية. تم تحديد النطاق الخطي لتحليل QDB للأجسام المضادة للأرانب المضادة ل CAPG باستخدام المحللات المحضرة من البروستاتا والكلى والطحال وباستخدام معيار بروتين CAPG المؤتلف المنقى. كانت النتائج في المتوسط ثلاث نسخ
.ويظهر هنا التحديد المطلق لمستويات CAPG في المحللات المحضرة من الكلى والطحال والبروستاتا في الفئران. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أربع إلى 24 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام جسم مضاد محدد مسبقا للإجراء بأكمله.
باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحليل الإحصاء الحيوي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية لا يمكن تحقيقها إلا من خلال القياس المطلق لمحتويات البروتين الفردية على مستوى الخلية أو الأنسجة. منذ تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث البروتينات لاستكشاف العلاقة المفترضة للمؤشرات الحيوية للبروتين مع الأمراض المختلفة على مستوى السكان. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تحليل QDB بتنسيق عالي الإنتاجية.
لا تنس أن العمل مع الأنسجة البشرية أو الحيوانية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام القفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة تحليل نقطي كمي (QDB) لتحديد المحتوى المطلق للبروتين المغطي للأكتين، الجلسولين-مثل (CAPG)، في أنسجة الفئران المختلفة. تتميز التقنية بعائدها العالي، بساطتها، والدقة الكمية، مما يجعلها مناسبة للتحقق من العلامات الحيوية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- بروتيوميات
الخلفية
- الطرق التقليدية لتقدير البروتين غالبًا ما تكون شبه كمية.
- هناك حاجة لتقنيات عالية الإنتاجية للتحقق الفعال من العلامات الحيوية.
- QDB يقدم بديلًا موثوقًا لقياس البروتين المطلق.
- البروتوكولات البسيطة تجعلها متاحة للباحثين ذوي المهارات المختبرية البسيطة.
هدف الدراسة
- لإظهار طريقة عالية الإنتاجية لتقدير البروتين المطلق.
- للتحقق من التقنية باستخدام CAPG كعلامة حيوية في أنسجة الفئران.
- لتوفير بروتوكول بسيط للباحثين في هذا المجال.
الطرق المستخدمة
- إعداد العينة باستخدام محاليل التحلل التقليدية.
- تجانس وترسيب عينات الأنسجة.
- استخدام بروتين معاد التركيب كمعيار للتقدير.
- التخفيف المتسلسل وتحميل العينات على ألواح QDB.
النتائج الرئيسية
- التقدير الناجح لمستويات CAPG في أنسجة الفئران.
- النطاق الخطي الموضح لتحليل QDB مع مختلف نواتج التحلل النسيجية.
- أظهرت النتائج الموثوقية والدقة عبر عينات متعددة.
- يمكن إكمال التقنية في بضع ساعات عند تنفيذها بشكل صحيح.
الاستنتاجات
- QDB هو أداة قيمة لتقدير البروتين المطلق.
- الطريقة بسيطة ويمكن إتقانها بسرعة من قبل المستخدمين الجدد.
- لها تطبيقات واسعة في كل من البيئات البحثية والسريرية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Quantitative dot blot analysis (QDB) addresses a critical gap in proteomics by enabling absolute, high-throughput protein quantification at the tissue level, which is essential for biomarker validation and pathway verification. The method provides reliable, reproducible data that supports cross-study comparison and large-scale analysis, reducing mechanistic ambiguity in target validation. Its simplicity and minimal skill requirements facilitate enterprise-wide adoption across discovery and translational workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables absolute quantification of target proteins like CAPG, supporting therapeutic hypothesis interrogation and biological de-risking.
- Operational Value: Uses simple lysis buffers and standard lab equipment, requiring minimal training for consistent execution.
- Predictive Value: Generates linear range data from recombinant standards, improving confidence in target engagement and pathway modulation assessments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, absolute protein measurements that enable reliable compound screening and dose-response analysis.
- Operational Value: Compatible with 96-well plate formats and microplate readers, supporting high-throughput screening scalability.
- Reuse Potential: Establishes a standardized, transferable assay platform for longitudinal protein monitoring across sample sets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Bridges discovery and preclinical stages by providing tissue-level protein data relevant to disease models.
- Risk Mitigation: Supports biomarker validation with absolute values, enhancing confidence in target-disease relationships.
- Continuity: Enables consistent protein tracking from early discovery through preclinical validation using the same quantitative method.
Pipeline & Workflow Integration
QDB fits within the discovery continuum by providing absolute protein quantification that informs target validation, enables assay-ready screening, and supports translational continuity through reproducible, quantitative outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through absolute measurement of target protein levels in disease-relevant tissues.
- Screening: Produces standardized, quantitative readouts compatible with high-throughput compound evaluation and hit confirmation.
- Analytics: Generates absolute concentration data (e.g., pg/µL) that allows direct comparison across samples, conditions, and studies.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by providing tissue-level protein data that correlates with phenotypic or clinical endpoints.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable, platform-agnostic capability for protein quantification across projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by eliminating semi-quantitative variability.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized protocols, blocking, washing, and detection steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing absolute protein data for target prioritization and portfolio triage.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions based on verified target expression levels in relevant tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoblotting, antibody validation, and protein standard handling.
- Depends on access to microplate readers, incubators, and standard lysis buffers (e.g., Triton X).
- Necessitates cross-team standardization of antibody dilution, loading volumes, and incubation times.
- Adaptation across model systems depends on tissue-specific lysis efficiency and antigen accessibility.
- Practical limitations include the need for validated antibodies and optimization of blocking and washing steps to minimize background.
![عد البروتينات في الخلايا المفردة مع الحبرية عنونة [ميكروارس]](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F56110.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A19.163Z&w=384&q=75)
