تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحفيز تحويل الخلايا الجرثومية إلى خلايا عصبية في C.elegans. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في التحقيق في الآثار المترتبة على العمليات البيولوجية ، مثل مسارات الإشارات أو علم التخلق في تنظيم إعادة برمجة المصير الخلوي. الميزة الرئيسية للطريقة الموضحة في هذا الفيديو هي أنه في الحية ، يمكن تحدي الخلايا الجرثومية من خلال الإفراط في التعبير عن عامل النسخ المسبب للمصير.

بينما في موازاة ذلك ، يمكن إجراء فحص جيني مثل شاشة RNAi من أجل تحديد العوامل الجديدة المتورطة في تنظيم إعادة البرمجة الخلوية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى العلاج التجديدي. لأنه يمكن استخدام طريقة in vivo هذه لدراسة إعادة البرمجة الخلوية في ظل ظروف تنموية وبيئية مختلفة.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب تعلم خطوات إعادة البرمجة. لأن النمط الظاهري لتحويل الخلية الجرثومية إلى الخلايا العصبية ، عند استنفاد لين 53 ، يحدث فقط في ظروف يتم التحكم فيها بعناية. بالنسبة لألواح RNAi ، قم بتحميل الألواح التي يبلغ طولها ستة سنتيمترات باستخدام NGM agar الذي يحتوي على IPTG و carbenicillin.

دعهم يجفوا لمدة 24 إلى 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ثم انقلها إلى أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى 14 يوما. بعد ذلك ، قم بتجميع الألواح الانتقائية الخطية التي تحتوي على الكربينيسلين والتتراسيكلين مع استنساخ بكتيريا RNAi مع بلازميد L4440 الذي يحمل جين lin-53.

استخدم نمط خطوط ثلاثي الطور ، وتأكد من وضع عنصر تحكم متجه فارغ. ثم قم بزراعة الصفائح بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، اختر ما لا يقل عن ثلاث مستعمرات مفردة ، وقم بتلقيح كل منها في أنبوب استزراع منفصل مع ملليلترين من LB ، مكملا بالكاربينيسيلين ، ولكن ليس التتراسيكلين.

خطط للحصول على ثلاث ثقافات صحية لكل حالة. بعد ذلك ، قم بزراعة الثقافات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية حتى تصل إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.6 إلى 0.8. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من كل مزرعة بكتيرية إلى لوحة NGM أجار RNAi بطول ستة سنتيمترات.

احتضن الأطباق طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في الظلام. تم تحسين هذا البروتوكول للديدان ذات سلالة BAT28 التي يتم الاحتفاظ بها عند 15 درجة مئوية ، حيث تكون الجينات المعدلة وراثيا أكثر استقرارا. يتم توفير تفاصيل حول علم الوراثة السلالة في النص.

تزامن العمر للديدان أمر بالغ الأهمية. استخدم تقنية التبييض. اغسل ألواح أجار NGM التي يبلغ طولها ستة سنتيمترات والتي تحتوي على بالغين وبيض باستخدام 800 ميكرولتر من M9. ثم حبيبات الديدان عن طريق الطرد المركزي ، وإزالة المادة الطافية.

بعد ذلك ، أضف 1/2 إلى مليلتر واحد من محلول التبييض للديدان. وأثناء مشاهدة الديدان تحت منظار مجسم ، هز الأنبوب حتى تبدأ الديدان البالغة في الانفجار ، ثم اجمع البيض. الآن ، افصل النفايات عن البيض.

أولا الطرد المركزي للأنبوب ، والتخلص من المادة الطافية. ثم اغسل حبيبات الأنسجة ب 800 ميكرولتر من M9 ثلاث مرات. تأكد من استخدام أجهزة الطرد المركزي لتجميع الأنسجة بين الغسيل.

الآن ، انقل البيض النظيف إلى أطباق NGM الطازجة المغطاة ببكتيريا OP50. تحقق بإيجاز من العزل الناجح للأجنة ونقلها إلى لوحات NGM. تنمو عند 15 درجة مئوية.

لتحقيق تحويل الخلايا الجرثومية إلى الخلايا العصبية عند استنفاد لين 53 ، يجب أن يبدأ النضوب في جيل الوالدين. لاستنفاد lin-53 ، أخضع L4 إلى RNAi. انقل يدويا 50 ديدان L4 لكل تكرار إلى لوحة NGM RNAi بدون بكتيريا.

استخدم سلكا بلاتينيا. يمكن التعرف على ديدان L4 بواسطة بقعة بيضاء في منتصف الطريق تقريبا على طول جوانبها البطنية. الآن ، احتضن الديدان عند 15 درجة مئوية في الظلام لمدة سبعة أيام تقريبا.

IPTG حساس للضوء. عندما يصل ذرية F1 إلى مرحلتي L3 و L4 ، افصلها عن الأبوية الأكبر والأكثر سمكا. في هذه المرحلة ، قم بفحص F1 بحثا عن النمط الظاهري للفرج البارز ، مما يشير إلى أن الحمض النووي الريبي ضد lin-53 كان ناجحا.

يمكن أن يؤدي نشاط الحمض النووي الريبي أيضا إلى الفتك ، والتي تزيد عن 15 درجة مئوية. لتنشيط che-1 ، والحث على تحويل الخلايا الجرثومية إلى الخلايا العصبية في ذرية F1 ، صدمة الديدان بالحرارة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام. استخدم حاضنة تهوية ، لأنها تسمح بصدمة حرارية أكثر كفاءة.

بعد الصدمة الحرارية ، احتضن الألواح عند 25 درجة مئوية طوال الليل في الظلام. من المهم تجنب إحداث الإفراط في التعبير عن che-1 عن طريق الصدمة الحرارية قبل أن تصل إلى منتصف المرحلة L3. هذا يمكن أن يؤدي إلى التعبير عن بروتين che-1 في الأنسجة غير المستهدفة.

في اليوم التالي ، قم بإعداد مصدر ضوء مضان ومرشح GFP لفحص بحثا عن التألق المشتق من الجينات المعدلة وراثيا في منطقة منتصف الجسم. لتقييم اختراق النمط الظاهري ، أوجد نسبة التي تصدر إشارة فلورسنت. عادة ما يظهر حوالي 30٪ إشارة GFP منفصلة.

بالمقارنة ، في التي تحمل ناقل الحمض النووي الريبي الفارغ ، حتى إشارة منتشرة في السلالة الجرثومية لا ترى في أكثر من 5٪ من السكان. توضح F1 التي تظهر النمط الظاهري للفرج البارز التطبيق الناجح ل lin-53 RNAi. في هذه ، يعد تحويل الخلايا الجرثومية إلى خلايا شبيهة بالخلايا العصبية ASE عند تحريض الصدمة الحرارية ل che-1 أمرا شائعا.

يكشف الفحص الدقيق عن إسقاطات شبيهة بالخلايا العصبية نموذجية للخلايا العصبية من الخلايا الجرثومية على النقيض من ذلك ، أظهرت أدوات التحكم في النواقل الفارغة الحد الأدنى من التعبير عن GFP ، والذي كان على الأكثر منتشرا. تفتقر الخلايا الجرثومية في هذه إلى ميزات شبيهة بالخلايا العصبية.

عندما كانت صغيرة جدا في وقت تحريض الإفراط في التعبير عن che-1 ، فإنها غالبا ما تعرض تعبيرا جينيا خارج الرحم في مناطق أخرى من الجسم ، مثل الفرج النامي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التخطيط بعناية وإجراء التجارب باستخدام الديدان الحية من أجل إعادة برمجة الخلايا الجرثومية إلى خلايا عصبية. ستسمح لك الطريقة الموضحة هنا في هذا الفيديو الآن بالتحقيق في الآثار المترتبة على عدد من العوامل المختلفة في تنظيم إعادة البرمجة الخلوية.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذا الإجراء في غضون 10 أيام. أثناء محاولة التجربة ، من المهم تنظيم بعناية قبل تحريض إعادة البرمجة ، والحفاظ على سلالة BAT28 عند 15 درجة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الحمض النووي الريبي المزدوج من أجل معالجة أسئلة إضافية مثل ، ما هي الآليات الأساسية التي تلعب دورا أثناء تحويلات مصير الخلية؟