طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

الهدف العام من هذه التقنية هو اختبار تأثيرات المركبات المختلفة على الكائنات الحية النموذجية C.elegans في مقايسة عالية الإنتاجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال الكيميائي والبيولوجي والشيخوخة ، مثل هل تطيل الهياكل الكيميائية المحددة عمر C.elegans؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بفحص العديد من المركبات بطريقة فعالة وسريعة من حيث الوقت.

لتحضير ألواح الاستزراع الجماعي لإنتاج أعداد كبيرة من الديدان ، في خزانة التدفق الصفحي ، قم أولا بتوزيع 30 مل من أجار متوسط نمو الديدان الخيطية 60 درجة مئوية على ألواح استزراع 10 سم للتصلب طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، أضف ملليلترين من الإشريكية القولونية المركزة على كل لوحة ، مع إمالة اللوحة وتدويرها لنشر البكتيريا بالكامل عبر سطح اللوحة. عندما تجف ألواح الاستزراع الجماعي ، قم بتخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.

لإعداد لوحات ثقافة مقايسة عالية الإنتاجية للفحص ، استخدم موزعا آليا ثماني قنوات لإضافة 0.15 مل من متوسط نمو الديدان الخيطية المنصهرة في كل بئر من صفيحة 96 بئر. دع الأجار يتماسك طوال الليل. ثم قم بتخزين لوحات الفحص عالية الإنتاجية عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.

لإعداد مزارع C.elegans ، استخدم معول دودة ومجهر تشريح لنقل 20 بيضة إلى كل صفيحة زراعة جماعية واحتضان الصفائح عند 20 درجة مئوية لمدة ستة أيام. في اليوم السابع ، استخدم مجهر تشريح لتأكيد وجود البويضات في الرحم بصريا. لجمع البالغين الحاملين ، استخدم ماصة زجاجية لإضافة ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من محلول S القاعدي لكل طبق وقم بتدوير المحاليل حول كل لوحة يدويا.

استخدم الماصة الزجاجية لنقل الديدان إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وحبيبات الديدان عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الديدان في 10 ملليلتر من محلول هيبوكلوريت وهز الأنابيب بسرعة لأعلى ولأسفل لمدة خمس ثوان. ثم احتضن الديدان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع رجها كل 2.5 دقيقة.

في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للديدان مرة أخرى. يجب أن تكون الكريات بنية مصفرة. استبدل المواد الطافية ب 10 مل من محلول هيبوكلوريت طازج وقم بهز الأنبوب بقوة مرة أخرى.

احتضن الديدان لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق أخرى مع الرج العرضي. عندما يتبقى البيض فقط ، قم بالطرد المركزي للأنابيب وشفط المواد الطافية. يجب أن تكون الكريات بيضاء بدون لون بني.

باستخدام تقنية معقمة ، افتح الأنابيب في خزانة تدفق رقائقي معقمة وأضف 14 مل من محلول S القاعدي إلى كل حبيبات. اغسل الحبيبات ثلاث مرات ب 14 مل من S Basal. بعد ثلاث غسلات بالطرد المركزي ، أعد تعليق البيض في ملليلترتين إلى ثلاثة ملليلترات من محلول S القاعدي الطازج.

لتحضير يرقات المرحلة L1 C.elegans ، انقل المواد الطافية إلى طبق بتري زجاجي معقم لكل أنبوب واستخدم ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من محلول S Basal لشطف البيض المتبقي من الأنابيب في كل طبق. أضف خمسة ملليلتر من محلول S Basal إلى كل طبق لتخفيف الازدحام وضع الطبق على شاكر مداري عند 20 درجة مئوية و 20 دورة في الدقيقة لمدة 16 إلى 24 ساعة لتشجيع الفقس. سيتم القبض على جميع الصغار في المرحلة الأولى من اليرقات بسبب نقص الطعام.

باستخدام ماصة مصلية ، انقل يرقات L1 إلى أنبوب سعة 15 مليلتر لطردها المركزي. بعد كل شيء تم توحيد L1 المفرغ من خلال الطرد المركزي والشفط المتكرر, أعد تعليق حبيبات اليرقة مع 10 ملليلتر من المحلول القاعدي S المعقم. بعد ذلك ، انقل 10 ميكرولتر إلى صفيحة غير مصنفة واحسب عدد اليرقات الموجودة على اللوحة.

كرر هذا 10 مرات للحصول على متوسط كثافة L1s في المحلول الخاص بك. باستخدام ماصة مصلية معقمة، حدد الحجم الكلي للمحلول الذي يحتوي على L1s. بعد ذلك ، استخدم حجم محلول L1 وكثافة L1s في المحلول لحساب العدد الإجمالي ل L1s الموجودة في الحل الخاص بك.

لوضع الديدان في لوحة فحص عالية الإنتاجية 96 بئر ، قم بتخفيف التعليق L1 إلى يرقة L1 واحدة لكل ميكرولتر في زجاجة وسائط مستديرة معقمة ، ومجهزة بقضيب تحريك بطيء إلى حد ما والسماح لألواح الفحص بالتسخين إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، في خزانة التدفق الصفحي ، أضف خمسة ميكرولترات من الإشريكية القولونية المركزة إلى كل بئر ، متبوعا ب 10 ميكرولترات من تعليق L1 لكل بئر لإنتاج 10 ديدان في المتوسط لكل بئر. عندما يتم طلاء جميع الديدان ، قم بتغطية الصفائح واحتضان الديدان لمدة يومين عند 25 درجة مئوية ، للسماح لليرقات بالتطور إلى بالغين.

في نهاية الحضانة ، قم بإحضار ألواح المكتبة الكيميائية إلى درجة حرارة الغرفة من التجمد. رج الألواح المذابة برفق عند 60 دورة في الدقيقة على شاكر دقيق لمدة دقيقة واحدة قبل الاستخدام مباشرة. باستخدام معالج سائل 96 آبار آلي ، انقل 0.75 ميكرولتر من المركب من لوحة المكتبة إلى لوحة الفحص.

عندما تتم معالجة جميع الآبار ، قم بتجفيف المركب بالهواء من سطح الألواح في خزانة تدفق رقائقي لمدة أربع إلى ثماني ساعات ، وإزالة الألواح الفردية بمجرد أن تجف. أغلق الألواح المجففة بغشاء شفاف وقم بتغطيتها. ثم قم بتدوير الألواح لمدة 45 ثانية عند 1000 جم وقم بتخزينها في الوضع المقلوب عند 25 درجة مئوية.

لاختبار استجابات C.elegans للمركبات ذات الأهمية ، يمكن استخدام لوحة تحكم سلبية لتسجيل إجمالي البقاء على قيد الحياة حتى تموت 95٪ من التحكم ، وعند هذه النقطة يمكن تسجيل جميع لوحات الاختبار. على سبيل المثال ، في هذه الدراسة ، لوحظت 57 ضربة من مكتبة إعادة الاختبار ل 179 مركبا ، مما يدل على أن 32٪ من المواد الكيميائية لإعادة الاختبار كانت إيجابية في المجموع. يشير تجميع متوسط النسبة المئوية لدرجات الاختبار السلبية لآبار التحكم والاختبار السلبية إلى أن آبار الاختبار تفوقت على آبار التحكم.

يمكن أيضا إجراء فحوصات صغيرة الحجم ، كما هو موضح في اختبار الاختبار التمثيلي هذا الذي تم فيه استخدام تركيزات 50 ميكرومولار و 100 ميكرومولار لمركب الاختبار. أشارت إعادة تسجيل لوحات اختبار الفحص ذات الشاشة الصغيرة هذه عندما يموت أكثر من 99٪ من المعالجة ذات التحكم السلبي ، إلى أن آبار التحكم الإيجابية تفوقت بكثير على آبار التحكم والاختبار السلبية من حيث أداء آبار الاختبار أفضل قليلا من الضوابط السلبية. في هذه التجربة ، كانت النتيجة الأخيرة متحيزة من خلال الإشارة إلى أن العديد من آبار الاختبار بدت وكأنها تظهر سمية بالنسبة لمعالجة التحكم ، مما أدى إلى إرباك هذا التفسير البسيط.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون أسبوعين إلى أربعة أسابيع إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. عند تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على سلامة لوحات الفحص ، والتأكد من أنها نقية قبل استخدامها. باتباع هذه التقنية ، يمكن الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل أي من هذه المركبات يحفز الفطريات الفطرية؟

بالنسبة لمقايسة Mytophagy ، سيتم استخدام خيط مراسل mytophagy. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون لديك فكرة جيدة عن كيفية إجراء شاشة كيميائية عالية الإنتاجية باستخدام C.elegans ككائن حي نموذجي.