قياس الطيف الكتلي الترادفي

يربط قياس الطيف الكتلي الترادفي معا مراحل متعددة من قياس الطيف الكتلي لعزل الجزيء الحيوي أولا ، ثم تحديد جوانب تركيبته الكيميائية. تحتوي الجزيئات الحيوية على هياكل كبيرة ومعقدة ، مما يجعل من الصعب تحديد تركيبتها الجزيئية. يختار قياس الطيف الكتلي الترادفي جزيئا ذا أهمية يتم تقسيمه لاحقا إلى وحدات فرعية متعددة ، مما قد يساعد في توضيح تحديده وتسلسله. سيعرض هذا الفيديو مفاهيم قياس الطيف الكتلي الترادفي ، وهو إجراء عام ، وبعض استخداماته في الكيمياء الحيوية.

يبدأ قياس الطيف الكتلي الترادفي كأداة نموذجية لمواصفات الكتلة: بمصدر أيوني ، يحول العينة إلى أيونات ، ومحلل كتلة ، يفصل الأيونات بناء على نسبة الكتلة إلى الشحنة. يسمح محلل الكتلة الشائع ، رباعي الأقطاب ، فقط بمرور الأيونات ذات نسبة محددة ، بينما يصطدم الآخرون بقضبان الجهاز. الأنواع المسموح بها ، والتي تسمى أيون السلائف ، هي الجزيء الحيوي المهم. يتحرك الأيون إلى خلية تصادم ، عادة ما تكون رباعية الأقطاب أخرى ، حيث يتم استخدام الطاقة لتفتيت الأيون بنمط يمكن التنبؤ به.

تنتقل هذه الأجزاء إلى محلل كتلة آخر ، مثل وقت الرحلة ، الذي يفصل بين هذه “أيونات المنتج”. ثم يتم إرسال أيونات المنتج إلى الكاشف ، كما هو الحال في أداة MS العادية. في حالة البروتين غير المعروف ، يحتوي الطيف الناتج على العديد من الأجزاء المتداخلة ، مما يجعل من الصعب إنشاء تسلسل كامل نهائي للجزيء الحيوي. ومع ذلك ، فإن النمط الطيفي فريد من نوعه لبروتين معين. يقارن برنامج التحليل الطيف بقاعدة بيانات لتسلسلات الببتيد المعروفة ، مما يوضح البروتين المجهول من الأجزاء المتداخلة.

اعتمادا على العينة ودرجة التجزئة المطلوبة ، يمكن طرق تجزئة متعددة. تعتمد أنماط التجزئة على كيفية نقل الطاقة وكميتها وكيفية توزيعها من خلال أيون السلائف. يمكن نقل الطاقة عبر الجسيمات المحايدة أو الإشعاع أو الإلكترونات. باستخدام الذرات المحايدة ، وهي عملية تسمى التفكك الناجم عن الاصطدام أو CID ، تشق بشكل أساسي في رابطة الببتيد بين الأحماض الأمينية ، وهي مثالية للتعرف عليها.

الآن بعد أن تمت تغطية أساسيات هذه التقنية ، دعونا نلقي نظرة على قياس الطيف الكتلي الترادفي CID المستخدم لدراسة أحد مكونات مغلفات الخلايا البكتيرية.

كما هو الحال مع جميع تجارب القياس الطيفي الكتلي ، فإن الخطوة الأولى هي تأين العينة. بالنسبة للجزيئات الحيوية ، يتم ذلك عادة باستخدام الامتصاص بالليزر بمساعدة المصفوفة أو تأين الرش الكهربائي. ثم يتم تحسين إشارة السلائف الأيونية عن طريق ضبط البصريات الأيونية. بمجرد الانتهاء من ذلك ، يتم عزل الهدف واختيار طريقة التجزئة ، مثل CID.

تؤثر قوة الجهد المطبق ، الذي يسرع أيون السلائف في خلية الاصطدام ، على درجة التجزئة. يزداد هذا الجهد حتى تصبح السلائف وفرة بنسبة 10٪ تقريبا مقارنة بأعلى أيون ناتج. يتم الحصول على أطياف متعددة وحساب متوسطها حتى يتم تحقيق نسبة إشارة إلى ضوضاء كافية. يعتمد عدد عمليات المسح المطلوبة على شدة إشارة أيون السلائف الأصلي ويمكن أن يتراوح من 3 إلى 300.

يحتوي التحليل في هذا المثال ، الدهون A من الإشريكية القولونية K-12 ، على 19 جزءا رئيسيا بعد CID. الهيكل العام ل Lipid A معروف جيدا ، مما يسمح للبرنامج بإعادة بناء التركيبة المحددة من العينة.

والآن بعد أن نظرنا في الإجراء، دعونا نلقي نظرة على بعض الطرق التي يستخدم بها قياس الطيف الكتلي الترادفي في الكيمياء الحيوية.

يتم تحديد وضع المسح الشائع في قياس الطيف الكتلي الترادفي لمراقبة التفاعل ، أو SRM. في SRM ، يتم تثبيت كلا محللي الكتلة بنسبة الكتلة إلى الشحن المحددة ، مع التركيز على أيونات السلائف والمنتجات المحددة. نظرا لدرجة حساسية SRM العالية ، يمكن استخدام أطياف معايير الببتيد ذات التركيز المعروف ومقارنتها بتلك الموجودة في العينات غير المعروفة ، مما يسمح بقياس البروتينات ذات الأهمية.

عادة ما يتم تعديل البروتينات بعد الترجمة ، عادة عن طريق إضافة مجموعات وظيفية مثل مجموعات الميثيل أو مجموعات الفوسفات أو السكريات المعروفة باسم الجليكان. هذه مهمة في عمليات إشارات الخلية ، وتوضح كيفية تواصل الخلايا مع بعضها البعض. نظرا لأن قياس الطيف الكتلي الترادفي يقسم البروتينات إلى مكونات أصغر ، فمن الممكن تحديد موقع PTM للجزء المحدد أو حتى الحمض الأميني. يصعب التمييز بين بعض التعديلات ، مثل الأستلة وثلاثي الميثيل ، حسب الكتلة وحدها ، لذلك يتم إجراء الفصل الكروماتوغرافي قبل قياس الطيف الكتلي.

تم العثور على العديد من التحليلات في دم المريض بتركيزات أقل من حد الكشف لقياس الطيف الكتلي النموذجي. ميزة أخرى ل SRM هي أنه يتخلص من جميع أيون المنتج باستثناء واحد ، مما يزيد من الحساسية ويعزز حد الكشف الأدنى بما يصل إلى 100 ضعف. في هذا المثال ، يمكن اكتشاف الدواء المثبط للمناعة ، تاكروليموس ، عند مستويات 1 نانوغرام / مل.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول قياس الطيف الكتلي الترادفي. وصف هذا الفيديو نظرية الأداة ، وانتقل إلى إجراء عام ، وشرح بعض الطرق التي يتم بها استخدام التقنية حاليا. شكرا للمشاهدة!