التحديد الكمي اكسين الذاتية وسيتوكينين خلال الثقافة Internode من عرق الذهب

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف كيفية تغير مستويات الهرمونات النباتية الذاتية أثناء تكوين البراعم العرضية في ipecac. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بتجديد الأنسجة في عجلة زراعة الأنسجة النباتية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي المستوى الداخلي لحمض Indole-3-acetic ويمكن تحليل السيتوكينين ببساطة بحساسية عالية.

يمتد تأثير هذه التقنية على طول إنشاء تنكس الأنسجة النباتية لأن التغيرات في مستوى الهرمونات النباتية الذاتية تؤدي إلى تكوين براعم عرضية. للبدء ، قم بإعداد وسط B5 خال من الهرمونات النباتية وأضف 0.2 في المائة من صمغ الجيلان. ثم ، قم بالتعقيم في الوسط لتعقيمه.

باستخدام مشرط جراحي على صفيحة أكريليك معقمة ، قم بتقطيع أجزاء داخلية بطول ثمانية ملليمترات من نبتات الإيبيك وضعها على الوسط. بعد ذلك ، قم بزراعة شرائح ipecac عند 24 درجة مئوية تحت 15 ميكرومول لكل متر مربع ثانية من الضوء في دورة ضوء مدتها 14 ساعة و 10 ساعات لمدة خمسة أسابيع. بعد زراعة شرائح ipecac ، حدد المناطق من واحد إلى أربعة في كل جزء.

مرة واحدة في الأسبوع ، استخدم مجهرا لحساب عدد البراعم العرضية في كل منطقة. أولا ، ضع حبة زركونيا بحجم خمسة ملليمترات في أربعة أنابيب عينة سعة ملليلتر. بعد ذلك ، استخدم مشرطا جراحيا على صفيحة أكريليك معقمة لتقطيع أجزاء ipecac إلى مناطق من الأول إلى IV ، ثم اجمع ثمانية أجزاء من كل منطقة في أنبوب عينة واحد.

قم بوزن كل عينة وقم بتجميدها في النيتروجين السائل. بعد ذلك ، استخدم الخالط القائم على الخرز لسحق العينات المجمدة. استخدم خلاطا دواميا لتعليق العينات في مليلتر واحد من الأسيتونيتريل مع 500 بيكوغرام من كل معيار داخلي للثيران و CKs.

قم بإضافة العينات إلى المنزل عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم قم بالطرد المركزي للعينات عند 3500 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الحبيبات في 80 في المائة من نتريل الأسيتال مع واحد بالمائة من حمض الأسيتيك.

ثم كرر الطرد المركزي واستخدم أنبوبا من الفئة يمكن التخلص منه للجمع بين المواد الطافية أضف 600 ميكرولتر من الماء مع واحد بالمائة من حمض الأسيتيك إلى المادة الطافية المركبة. ثم استخدم مكثف فراغ لتبخير نتريل الأسيتال.

قم بتحميل حلول العينات في خراطيش HLB فردية متوازنة. واغسل الخراطيش بمليلتر واحد من الماء مع واحد بالمائة من حمض الأسيتيك. ثم ألمح إلى جميع الهرمونات التي تحتوي على ملليلترين من 80 في المائة من أسيتيل النتريل مع واحد بالمائة من حمض الأسيتيك في أنبوب زجاجي.

باستخدام مكثف فراغ ، قم بتبخير نتريل الأسيتال للحصول على مستخلص في الماء يحتوي على واحد بالمائة من حمض الأسيتيك. قم بتحميل محاليل العينات في خراطيش MCX الفردية المتوازنة واغسل الخراطيش بمليلتر واحد من الماء مع واحد بالمائة من حمض الأسيتيك. ثم ألمح إلى IAA في أنبوب زجاجي ، مع ملليلترين من 30 في المائة من نتريل الأسيتال مع واحد بالمائة من حمض الخليك.

ثم اغسل الخراطيش بملليلترين من 80 في المائة من نتريل الأسيتال مع واحد بالمائة من حمض الأسيتيك. بعد ذلك ، اغسل الخراطيش بملليلترين من الماء ومليلتر واحد من الماء مع خمسة بالمائة من الأمونيا المائية في غرفة السحب. ألمح إلى CKs في أنبوب زجاجي يحتوي على ملليلترين من 60 في المائة من نتريل الأسيتال مع خمسة بالمائة من الأمونيا المائية في غرفة السحب.

ثم استخدم مكثف فراغ لتبخير مذيب كل جزء هرموني. حرك العينات عند درجة حرارة ثلاثين درجة مئوية تحت الصفر حتى تحليل LCMSMS. أولا ، قم بإذابة كل مستخلص هرمون في أنبوب يحتوي على 600 ميكرولتر من الميثانول.

ثم انقل المحلول إلى قارورة استرداد كاملة برقبة لولبية واستخدم مكثف فراغ لتبخير المذيب. قم بإذابة جزء IAA في 20 ميكرولترا من 30 في المائة من نتريل الأسيتال وكسور CK في 20 ميكرولترا من الماء مع واحد بالمائة من حمض الأسيتيك. بعد ذلك ، استخدم نظام MS رباعي الأقطاب ثلاثي المزمار مزود بنظام HPLC لتحليل العينات في وضع الأيونات الموجبة.

أخيرا ، قم بتحديد IAA الذاتي في مستويات CK مقابل منحنى قياسي لحصة معايير تسمية الديوتيريوم غير المصنفة. في هذا البروتوكول ، تم قياس السيتوكينين المؤكسد الذاتي في المزالق العرضية عبر LCMSMS لمدة خمسة أسابيع. في الأسبوع الأول ، لم تتشكل أي مزالق عرضية وظهرت المزالق الصغيرة الأولى خلال الأسبوع الثاني.

خلال الأسبوعين الثالث والرابع ، زاد عدد المزالق في الغالب في الحكام الأول والثاني. خلال الأسبوع الخامس ، كان عدد المزالق حوالي سبعة في المنطقة الأولى ، وخمسة في المنطقة الثانية. قبل الاستزراع ، كان مستوى IAA أعلى قليلا في المنطقة الأولى منه في المناطق الثانية والثالثة والرابعة.

خلال الأسبوع الأول ، ارتفع مستوى IAA بشكل كبير في المنطقة الرابعة ، وانخفض بشكل طفيف في المناطق الأولى والثانية والثالثة. بحلول خمسة أسابيع من الاستزراع ظهر تدرج تركيز IAA. مع زيادة المستويات من المنطقة الأولى إلى المنطقة الرابعة.

قبل الثقافة ، لم يكن هناك سوى مستويات ضئيلة لمعظم CKs. في الأسبوع الأول ، ارتفع مستوى tZR إلى 13.8 بيكوغرام لكل مليغرام في المنطقة الثانية. و 18.1 بيكوغرام لكل ملليغرام في المنطقة الثالثة.

في المقابل ، تغيرت مستويات tZ و iP و iPR بشكل طفيف فقط أثناء الاستزراع. أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن هرمون الجزء الذاتي مستقرة. بعد أن تم تطوير الإنسان ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال زراعة الأنسجة النباتية.

لاستكشاف التكوين العرضي في الكائنات الحية الأخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل حمض الإندول -3-الخليك الداخلي والسيتوكينينات.