Name: التحديد الكمي اكسين الذاتية وسيتوكينين خلال الثقافة Internode من عرق الذهب (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: اكتشف تحليل مستويات الأوكسين والسيتوكينين الذاتية بتقنية LC-MS/MS خلال تكوين البراعم العرضية في نبات عرق الذهب. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات تجديد الأنسجة النباتية بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونحن ممتنون للسيد أكيرا موراكامي من قسم العلوم التطبيقية وجامعة تويو والسيد كودي تانيجوشى المركز التكنولوجيا الزراعية جونما للمساعدة التقنية. ونحن ممتنون أيضا للبروفيسور شوساكو كاشيوادا والدكتور Uma الج يجلاب، جامعة تويو لاقتراحاتهم. وأيد في مركز أبحاث هذه الدراسة جزئيا للحياة، والعلوم البيئية، جامعة تويو.

ملاحظة: استخدمت عرق الذهب (C. يهيجون) في هذه الدراسة نظراً لأنها تسهل تحليل phytohormones الذاتية.
1-النمو الظروف للحث على العارض يطلق النار على من عرق الذهب
<ol><li>تعد خالية من فيتوهورموني المتوسطة B5 تعديلها لدرجة الحموضة 5.710، وإضافة الصمغ جيلان 0.2%. تعقيم بالتعقيم.</li>
	<li>صب 25 مل الوسط يعقم في طبق بتري معقم (90 ملم × 20 ملم).</li>
	<li>قطع شرائح internodal 8 مم من النبيتات عرق الذهب باستخدام مشرط جراحي مع شفرة رقم 22 على لوح اكريليك عقيمة، ووضع في المتوسط (الشكل 1).</li>
	<li>الثقافة في B5 خالية من فيتوهورموني المتوسطة في 24 درجة مئوية تحت 15 µmol م2 ق1 من الضوء في دائرة الضوء/10-ح 14-ح الظلام لمدة 5 أسابيع.</li>
	<li>تحديد المناطق وأنا (قمي) إلى الرابع (القاعدية) في كل قطاع (الشكل 1ب). حساب عدد يطلق النار العرضي > 0.3 مم طول في كل منطقة تحت مجهر مرة واحدة في أسبوع.</li>
</ol>2-استخراج وتنقية فيتوهورمونيس
<ol><li>وضع حبة زركونيا 5 مم في كل من أربعة أنابيب العينة 2 مل.</li>
	<li>مقطعة الشرائح مناطق الأول إلى الرابع (كل 2 مم في الطول) باستخدام مشرط جراحي على لوح اكريليك عقيمة.</li>
	<li>جمع القطع ثمانية من كل منطقة في نموذج منفصل أنابيب (10-30 ملغ الوزن الطازج).</li>
	<li>وزن، ومن ثم تجميد العينات في نيتروجين سائل.</li>
	<li>سحق العينات المجمدة باستخدام الخالطون المستندة إلى حبة.</li>
	<li>تعليق العينات التي سحقت في 1 مل الاسيتو الانيتريل تحتوي على 500 بيكوغرام لكل معيار الداخلية من اكسين و CKs (د5-الأكاديمية، د5-tZ، تزر-د5، د6-الملكية الفكرية، د6-حقوق الملكية الفكرية) باستخدام خلاط دوامة.</li>
	<li>عقد في 4 درجات مئوية عن ح 1، ثم الطرد المركزي في × 3,500 ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>أغسل بيليه في الاسيتو الانيتريل 80% (v/v) الذي يحتوي على حمض الخليك 1% (v/v). أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 3,500 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الجمع بين سوبيرناتانتس (من الخطوات 2.7 و 2.8) في أنبوب زجاج القابل للتصرف.</li>
	<li>إضافة 600 ميليلتر المياه التي تحتوي على حمض الخليك 1% (v/v) لكل المادة طافية مجتمعة، وتتبخر الاسيتو الانيتريل استخدام مركز فراغ.</li>
	<li>حجته ماء-محبتين متوازنة خراطيش العمود (HLB) عن طريق تطبيق 1 مل الاسيتو الانيتريل، والميثانول، والمياه التي تحتوي على حمض الخليك 1% (v/v).</li>
	<li>تطبيق الحل عينة واحدة كل متوازن HLB خرطوشة.</li>
	<li>أغسل الخراطيش مع 1 مل من الماء الذي يحتوي على حامض الخليك 1% (v/v).</li>
	<li>الوت جميع هرمونات مع 2 مل 80% (v/v) الاسيتو الانيتريل المحتوية على حمض الخليك 1% (v/v) في أنبوب زجاج.</li>
	<li>تتبخر في الاسيتو الانيتريل في النذرة الحصول على استخراج في المياه التي تحتوي على حمض الخليك 1% (v/v) باستخدام مركز فراغ. ملاحظة: لم يجف هذا تماما.</li>
	<li>حجته خراطيش العمود وضع مختلط، القوى الموجبة تبادل (MCX) عن طريق تطبيق الاسيتو الانيتريل مل 1، 1 مل الميثانول، مل 0.5 0.1 M HCl، و 1 مل من الماء الذي يحتوي على حامض الخليك 1% (v/v).</li>
	<li>تطبيق الحل عينة واحدة كل متوازن MCX خرطوشة.</li>
	<li>أغسل الخراطيش مع 1 مل من الماء الذي يحتوي على حامض الخليك 1% (v/v).</li>
	<li>الوت الأكاديمية مع 2 مل 30% (v/v) الاسيتو الانيتريل المحتوية على حمض الخليك 1% (v/v) في أنبوب زجاج.</li>
	<li>أغسل الخراطيش مع 2 مل 80% (v/v) الاسيتو الانيتريل المحتوية على حمض الخليك 1% (v/v).</li>
	<li>أغسل الخراطيش مع 2 مل من الماء والماء 1 مل يحتوي على 5% مائي الأمونيا.</li>
	<li>الوت CKs مع 2 مل 60% (v/v) الاسيتو الانيتريل التي تحتوي على 5% مائي الأمونيا في أنبوب زجاج.</li>
	<li>يتبخر المذيب لكل جزء الهرمون استخدام مركز فراغ وتخزينها في −30 درجة مئوية حتى التحليل LC-MS/MS.</li>
</ol>3-LC-MS/MS تحليل الأكاديمية و CKs
<ol><li>حل كل استخراج هرمون في أنبوب مع 600 ميليلتر من الميثانول ونقل الحل إلى قنينة انتعاش الكلي الرقبة المسمار. تتبخر المذيبات استخدام مركز فراغ.</li>
	<li>حل الكسر الأكاديمية في ميليلتر 20 30% (v/v) الاسيتو الانيتريل، والكسور كورونا تشيكية في 20 ميليلتر المياه التي تحتوي على حمض الخليك 1% (v/v) في المسمار الرقبة الانتعاش الكلي القنينات.</li>
	<li>تحليل العينات في وضع أيون إيجابية على نظام MS ثلاثي-الرباعي مجهزة بنظام [هبلك]. ملاحظة: وضعنا الشروط [هبلك] كما هو موضح في الجدول 1.<ol>
<li>شطف الأكاديمية، استخدام تدرج ثنائي من 5-50% ب المذيبات ما يزيد على 7 دقائق، ثم زيادة بالمذيبات 98% ب وعقد لمدة 1 دقيقة، وحجته ثم لمدة 2 دقيقة في 5 ٪ مذيب ب عن طريق الحقن عش.</li>
		<li>شطف كورونا تشيكية، استخدام تدرج ثنائي 2-40 ٪ المذيبات باكثر من 5 دقائق، المذيبات 40 إلى 70% ب في 7 دقيقة، ثم زيادة بالمذيبات 95% ب وعقد لمدة 1 دقيقة، وحجته ثم لمدة 2 دقيقة في المذيبات 2% ب بعش الحقن.</li>
		<li>تعيين التأين اليكتروسبراي (ESI)-معلمات MS لايون المصدر كما هو موضح في الجدول 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>استخدام ردود فعل متعددة رصد الانتقال (MRM) للتحديد الكمي لكل أكثر المدرجة في الجدول 3.</li>
	<li>قياس المستويات الأكاديمية وكورونا تشيكية الذاتية ضد منحنى قياسي للنسبة غير مسمى للمعايير يسمى الديوتريوم.</li>
</ol>

<ol><li>Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).</li>
<li>Skoog, F., Miller, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+regulation+of+growth+and+organ+formation+in+plant+tissues+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Symp+Soc+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro.</a> Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).</li>
<li>Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. <a target="_blank" href="NULL">Transgenic plants and crops</a>. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).</li>
<li>Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+emetic+alkaloid+by+in+vitro+culture+of+Cephaelis+ipecacuanha%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).</li>
<li>Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. <a target="_blank" href="https://www.amazon.com/Cultivation-Utilization-Medicinal-Plants-Kapur/dp/B001I6AQI6">Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research</a>. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).</li>
<li>Bajaj, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/biotechnology/abstract/0167-7799(94)90092-2">Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).</li>
<li>Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24241769">Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha.</a> Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).</li>
<li>Yoshimatsu, K., Shimomura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+shoot+formation+on+internodal+segments+and+alkaloid+formation+in+the+regenerates+of+Cephaelis+ipecacuanha+A.+Richard%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard.</a> Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).</li>
<li>Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00344-017-9684-8">Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac.</a> J. Plant Growth Regul. , (2017).</li>
<li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).</li>
<li>Watad, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0304423896008746">Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures.</a> Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).</li>
<li>Ajithkumar, D., Seeni, S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s002990050418">Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree.</a> Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).</li>
<li>Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1010652006417">Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).</li>
<li>Rao, M. S., Purohit, S. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10535-006-0079-0">In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd.</a> Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).</li>
<li>Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-005-9050-6">TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).</li>
<li>Yoshimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+negatively+regulates+cell+death+by+controlling+NPR1-dependent+salicylic+acid+signaling+during+senescence+and+the+innate+immune+response+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).</li>
<li>Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin-yang+of+hormones%3A+cytokinin+and+auxin+interactions+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development.</a> Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).</li>
</ol>

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب في المصالح.

لتحديد توزيع phytohormones المشاركة في أورجانوجينيسيس، من المهم أن استخدام المواد النباتية التي يمكن ملاحظتها organogenesis في المتوسط خالية من فيتوهورموني، لأنه عندما يتم تطبيق phytohormones مناشئ explants لحمل البراعم أو الجذور، وهي تؤثر explant كله، مما يجعل من الصعب تقييم اللدونة الملازمة للنباتات في تمايز الخلايا وأورجانوجينيسيس. يمكن الناجمين عن العارض يطلق النار على وسائط ثقافة خالية من فيتوهورموني في الأنواع النباتية الأخرى مثل قرنفل شائع ل.11، كوريا مارميلوس عاجل (لام)<s...

واقترح غوتليب هابيرلاندت (1854-1945) مفهوم "توتيبوتينسي"، بالنبات الذي الخلايا يمكن تقسيم والتفريق وتجديد محطات كاملة حتى بعد تلك التفرقة السابقة إلى أنواع محددة من الخلايا في النباتات الناضجة1. في زراعة الأنسجة، ما إذا كان يمكن فعل تجديد النبات أو لا يتحدد بتركيبة وتركيز phytohormones مناشئ التطبيقية في الأجلين المتوسط والنمو. وجد سكوغ وميلر يمكن التي يسببها العارض يطلق النار على من دشبذ التبغ في الثقافة المتوسطة التي تحتوي على نسبة عالية من CKs إلى auxins، بينما يمكن الناجمين عن جذور العارض في المتوسطة التي تحتوي على نسبة منخفضة من2. منذ ذلك الاستنتاج، زراعة الأنسجة وقد استخدمت على نطاق واسع لنشر المحاصيل الهامة اقتصاديا والتجديد للنباتات المعدلة وراثيا3. يمكن التي يسببها العارض يطلق النار على من الأنسجة عدا أرض قمية تبادل لإطلاق النار، مثل الأوراق والجذور، وإينتيرنوديس. العلاج فيتوهورموني مطلوب لاستحثاث يطلق النار العرضي في معظم الأنواع النباتية. بيد أن التركيزات المثلى وتركيبات تختلف حسب الأنواع وبين الأنسجة المستخدمة ك explants. وهكذا، بذل الكثير من الجهد يذهب إلى تحديد التركيزات المثلى وتركيبات من فيتوهورمونيس للتجارب.
يهيجون كارابيتشيا (الخبز). L. أندرسون (عرق الذهب) هو النباتات طبية التي تحتوي على قلويدات مثل اميتيني وسيفايليني، أساسا في الجذور4. مقتطفات الجذر تستخدم مقشع، قيء، وأموبيسيدي5. على الرغم من عرق الذهب ينمو بشكل طبيعي في الغابات المطيرة الاستوائية من البرازيل، أنها مترددة في وضع البذور في الثقافة، ويقلل من معدل الإنبات أثناء تخزين البذور في اليابان، مع أن المناخ الأكثر برودة6. بدلاً من ذلك، فإنه يتم نشر بزراعة الأنسجة، في تبادل لإطلاق النار العرضي الذي هو تشكيل في إينتيرنوديس7،الأسلوب الأكثر كفاءة8. من المثير للاهتمام، يمكن فعل العارض يطلق النار على في هذه الأنواع دون علاج فيتوهورموني8.
وتتشكل يطلق النار العرضي على البشرة في منطقة قمي شرائح internodal دون كالوسينج، ولكن ليس في المنطقة القاعدية9. هذا الاختلاف يشير إلى قطبية الأنسجة في قطاعات internodal، الذي على الأرجح تحت لائحة فيتوهورمونال. ويسمح نظام الثقافة عرق الذهب فرصة فريدة لتحليل التغيرات في مستويات فيتوهورموني الذاتية خلال تبادل لإطلاق النار العرضي تشكيل. أعرض هنا ونحن لدينا طريقة لتحليل مستويات الذاتية اكسين واحد (حمض اندول-3-أنهيدريد (IAA)) وأربعة CKs (isopentenyl الأدنين (iP)، إيسوبينتينيل الأدنين المواد (حقوق الملكية الفكرية)، ترانس-أنها (tZ)، و عبر-أنها المواد (تزر)) في internodal شرائح من خلال استخدام LC-MS/MS.

<table><tbody><tr><td>[2H5] indole-3-acetic acid</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>031 1531</td><td>المعيار الداخلي ل LC-MS / MS</td></tr> <tr><td>[2H5] عبر zeatin</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0301</td><td>المعيار الداخلي ل LC-MS / MS</td></tr> <tr><td>[2H5] عبر الزياتين ريبوسيد</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0311</td><td>المعيار الداخلي ل LC-MS / MS</td></tr> <tr><td>[2H6] N6-isopentenyl adenine</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0161</td><td>المعيار الداخلي ل LC-MS / MS</td></tr> <tr><td>[2H6] N6-isopentenyl adenosine</td><td>Olchemlm Ltd</td><td>030 0171</td><td>المعيار الداخلي ل LC-MS / MS</td></tr><tr><td>إندول -3-حمض الخليك</td><td>واكو</td><td>098 00181</td><td>معيار ل LC-MS / MS</td></tr><tr><td>عبر zeatin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z0876 معيار 5MG</td><td>ل LC-MS / MS</td></tr><tr><td>عبر زيتين ريبوسيد</td><td>واكو</td><td>262 01081</td><td>معيار ل LC-MS / MS</td></tr><tr><td>N6-isopentenyl معيار الأدينين</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D7674 1G</td><td>ل LC-MS / MS</td></tr><tr><td>N6-ISOPENTENYL adenosine</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>22648 1000</td><td>القياسي ل LC-MS / MS</td></tr><tr><td>الأسيتونيتريل الهايبرgrade ل LC-MS LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.00029.1000</td><td>المذيب ل LC-MS /</td></tr><tr><td>MS الماء للكروماتوغرافيا LiChrosolv</td><td>MERCK</td><td>1.15333.1000</td><td>المذيب ل LC-MS / MS</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>SHIMADZU</td><td>Prominence</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Sciex</td><td>3200QTRAP</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 30 مجم / 1 سم مكعب</td><td>ووتر</td><td>WAT094225</td><td>عمود خرطوشة</td></tr><tr><td>Oasis MCX 30 مجم / 1 سم مكعب</td><td>المياه</td><td>186000252</td><td>خرطوشة عمود</td></tr><tr><td>برغي عنق قنينة استرداد كاملة</td><td>المياه</td><td>186002805</td><td></td></tr><tr><td>أزرق ، غطاء عنق لولبي 12 × 32 مم و PTFE / سيليكون الحاجز</td><td>المياه</td><td>186000274</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C18 ، 2.1 × 100 مم</td><td>ووتشرز</td><td>186002350</td><td>عمود UPLC</td></tr><tr><td>Proshell 120 EC-C18 ، 2.1 × 50 مم</td><td>Agilent</td><td>699775-902</td><td>عمود UPLC</td></tr><tr><td>مجهر رقمي</td><td>Leica</td><td>DHS1000</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>شفرة جراحية</td><td>ريشة</td><td>رقم 22</td><td></td></tr><tr><td>مقبض مشرط</td><td>ريشة</td><td>رقم 4</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac / مصيدة بخار مجددة</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD111 / RVT4104</td><td>مكثف</td></tr><tr><td>فراغ زجاج قابل للتصرف (13x100 مم)</td><td>IWAKI</td><td>9832-1310</td><td></td></tr><tr><td>طبق بتري معقم</td><td>INA OPTICA</td><td>I-90-20</td><td></td></tr></tbody></table>

التحديد الكمي اكسين الذاتية وسيتوكينين خلال الثقافة internode من عرق الذهب

Quantification of Endogenous Auxin and Cytokinin During Internode Culture of Ipecac

تشكيل إطلاق النار العرضي أسلوب هام للدعوة للمحاصيل الهامة اقتصاديا والتجديد للنباتات المعدلة وراثيا. العلاج فيتوهورموني مطلوب لاستحثاث يطلق النار العرضي في معظم الأنواع. عما إذا كان يمكن أن يتسبب العارض يطلق النار على تتحدد بالتوازن بين اكسين وسيتوكينين (كورونا) مستويات. يذهب الكثير من الجهد في تحديد التركيزات المثلى وتركيبات من فيتوهورمونيس في كل الأنسجة المستخدمة اكسبلانتس وفي كل نوع من الأنواع النباتية. في عرق الذهب، يمكن فعل بيد من يطلق النار العرضي في قطاعات internodal في المتوسط الثقافة دون علاج فيتوهورموني. وهذا ما يسمح اللدونة الملازمة لعرق الذهب للتمايز الخلية التي يتم تقييمها. للحث على براعم العارض في عرق الذهب، نحن مثقف شرائح internodal في 24 درجة مئوية تحت 15 µmol م2 ق1 من الضوء في حلقة مفرغة الظلام الضوء/10-ح 14-ح على خالية من فيتوهورموني المتوسطة B5 توطد مع الصمغ جيلان 0.2 في المائة لمدة 5 أسابيع. للتحقيق في ديناميات فيتوهورموني خلال تبادل لإطلاق النار العرضي تشكيل، نحن تقاس حمض اندول-3-أنهيدريد الذاتية و CKs في القطاعات السائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي LC-MS/MS. هذا الأسلوب يسمح تحليل حمض اندول-3-أنهيدريد الذاتية ومستويات CKs بطريقة بسيطة. يمكن تطبيقها للتحقيق في ديناميات اكسين الذاتية وكورونا خلال organogenesis في الأنواع النباتية الأخرى.

وشكلت في الأسبوعش 1، لم يطلق النار العرضي. في الأسبوع 2nd ، ظهرت براعم صغيرة. 3rd والأسابيعال 4، العدد يطلق النار على زيادة معظمها في منطقتي قمي (الأول والثاني) (الشكل 2أ). في الأسبوعال 5، عدد من يطلق النار كان حوالي 7 المنطقة في أنا و 5 في المنطقة الثانية (الشكل 2ب). وفي المقابل، شكلت يطلق النار على عدد قليل فقط في الأقاليم الثالث والرابع.</...

يمكن الناجمين عن العارض يطلق النار على شرائح internodal من عرق الذهب بدون علاج فيتوهورموني. تقييم ديناميات فيتوهورموني خلال تبادل لإطلاق النار العرضي تشكيل، قمنا بقياس اكسين الذاتية وسيتوكينين في قطاعات internodal قبل LC-MS/MS.

التحديد الكمي اكسين الذاتية وسيتوكينين خلال الثقافة Internode من عرق الذهب

Adventitious shoot formation is an important technique for the propagation of economically important crops and for the regeneration of transgenic plants. ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف كيفية تغير مستويات الهرمونات النباتية الذاتية أثناء تكوين البراعم العرضية في ipecac. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بتجديد الأنسجة في عجلة زراعة الأنسجة النباتية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي المستوى الداخلي لحمض Indole-3-acetic ويمكن تحليل السيتوكينين ببساطة بحساسية عالية.يمتد تأثير هذه التقنية على طول إنشاء تنكس الأنسجة النباتية لأن التغيرات في مستوى الهرمونات النباتية الذاتية تؤدي إلى تكوين براعم عرضية. للبدء ، قم بإعداد وسط B5 خال من الهرمونات النباتية وأضف 0.2 في المائة من صمغ الجيلان. ثم ، قم بالتعقيم في الوسط لتعقيمه.باستخدام مشرط جراحي على صفيحة أكريليك معقمة ، قم بتقطيع أجزاء داخلية بطول ثمانية ملليمترات من نبتات الإيبيك وضعها على الوسط. بعد ذلك ، قم بزراعة شرائح ipecac عند 24 درجة مئوية تحت 15 ميكرومول لكل متر مربع ثانية من الضوء في دورة ضوء مدتها 14 ساعة و 10 ساعات لمدة خمسة أسابيع. بعد زراعة شرائح ipecac ، حدد المناطق من واحد إلى أربعة في كل جزء.مرة واحدة في الأسبوع ، استخدم مجهرا لحساب عدد البراعم العرضية في كل منطقة. أولا ، ضع حبة زركونيا بحجم خمسة ملليمترات في أربعة أنابيب عينة سعة ملليلتر. بعد ذلك ، استخدم مشرطا جراحيا على صفيحة أكريليك معقمة لتقطيع أجزاء ipecac إلى مناطق من الأول إلى IV ، ثم اجمع ثمانية أجزاء من كل منطقة في أنبوب عينة واحد.قم بوزن كل عينة وقم بتجميدها في النيتروجين السائل. بعد ذلك ، استخدم الخالط القائم على الخرز لسحق العينات المجمدة. استخدم خلاطا دواميا لتعليق العينات في مليلتر واحد من الأسيتونيتريل مع 500 بيكوغرام من كل معيار داخلي للثيران و CKs.قم بإضافة العينات إلى المنزل عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم قم بالطرد المركزي للعينات عند 3500 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الحبيبات في 80 في المائة من نتريل الأسيتال مع واحد بالمائة من حمض الأسيتيك.ثم كرر الطرد المركزي واستخدم أنبوبا من الفئة يمكن التخلص منه للجمع بين المواد الطافية أضف 600 ميكرولتر من الماء مع واحد بالمائة من حمض الأسيتيك إلى المادة الطافية المركبة. ثم استخدم مكثف فراغ لتبخير نتريل الأسيتال.قم بتحميل حلول العينات في خراطيش HLB فردية متوازنة. واغسل الخراطيش بمليلتر واحد من الماء مع واحد بالمائة من حمض الأسيتيك. ثم ألمح إلى جميع الهرمونات التي تحتوي على ملليلترين من 80 في المائة من أسيتيل النتريل مع واحد بالمائة من حمض الأسيتيك في أنبوب زجاجي.باستخدام مكثف فراغ ، قم بتبخير نتريل الأسيتال للحصول على مستخلص في الماء يحتوي على واحد بالمائة من حمض الأسيتيك. قم بتحميل محاليل العينات في خراطيش MCX الفردية المتوازنة واغسل الخراطيش بمليلتر واحد من الماء مع واحد بالمائة من حمض الأسيتيك. ثم ألمح إلى IAA في أنبوب زجاجي ، مع ملليلترين من 30 في المائة من نتريل الأسيتال مع واحد بالمائة من حمض الخليك.ثم اغسل الخراطيش بملليلترين من 80 في المائة من نتريل الأسيتال مع واحد بالمائة من حمض الأسيتيك. بعد ذلك ، اغسل الخراطيش بملليلترين من الماء ومليلتر واحد من الماء مع خمسة بالمائة من الأمونيا المائية في غرفة السحب. ألمح إلى CKs في أنبوب زجاجي يحتوي على ملليلترين من 60 في المائة من نتريل الأسيتال مع خمسة بالمائة من الأمونيا المائية في غرفة السحب.ثم استخدم مكثف فراغ لتبخير مذيب كل جزء هرموني. حرك العينات عند درجة حرارة ثلاثين درجة مئوية تحت الصفر حتى تحليل LCMSMS. أولا ، قم بإذابة كل مستخلص هرمون في أنبوب يحتوي على 600 ميكرولتر من الميثانول.ثم انقل المحلول إلى قارورة استرداد كاملة برقبة لولبية واستخدم مكثف فراغ لتبخير المذيب. قم بإذابة جزء IAA في 20 ميكرولترا من 30 في المائة من نتريل الأسيتال وكسور CK في 20 ميكرولترا من الماء مع واحد بالمائة من حمض الأسيتيك. بعد ذلك ، استخدم نظام MS رباعي الأقطاب ثلاثي المزمار مزود بنظام HPLC لتحليل العينات في وضع الأيونات الموجبة.أخيرا ، قم بتحديد IAA الذاتي في مستويات CK مقابل منحنى قياسي لحصة معايير تسمية الديوتيريوم غير المصنفة. في هذا البروتوكول ، تم قياس السيتوكينين المؤكسد الذاتي في المزالق العرضية عبر LCMSMS لمدة خمسة أسابيع. في الأسبوع الأول ، لم تتشكل أي مزالق عرضية وظهرت المزالق الصغيرة الأولى خلال الأسبوع الثاني.خلال الأسبوعين الثالث والرابع ، زاد عدد المزالق في الغالب في الحكام الأول والثاني. خلال الأسبوع الخامس ، كان عدد المزالق حوالي سبعة في المنطقة الأولى ، وخمسة في المنطقة الثانية. قبل الاستزراع ، كان مستوى IAA أعلى قليلا في المنطقة الأولى منه في المناطق الثانية والثالثة والرابعة.خلال الأسبوع الأول ، ارتفع مستوى IAA بشكل كبير في المنطقة الرابعة ، وانخفض بشكل طفيف في المناطق الأولى والثانية والثالثة. بحلول خمسة أسابيع من الاستزراع ظهر تدرج تركيز IAA. مع زيادة المستويات من المنطقة الأولى إلى المنطقة الرابعة.قبل الثقافة ، لم يكن هناك سوى مستويات ضئيلة لمعظم CKs. في الأسبوع الأول ، ارتفع مستوى tZR إلى 13.8 بيكوغرام لكل مليغرام في المنطقة الثانية. و 18.1 بيكوغرام لكل ملليغرام في المنطقة الثالثة.في المقابل ، تغيرت مستويات tZ و iP و iPR بشكل طفيف فقط أثناء الاستزراع. أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن هرمون الجزء الذاتي مستقرة. بعد أن تم تطوير الإنسان ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال زراعة الأنسجة النباتية.لاستكشاف التكوين العرضي في الكائنات الحية الأخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل حمض الإندول -3-الخليك الداخلي والسيتوكينينات.

quantification-endogenous-auxin-cytokinin-during-internode-culture

Research

JoVE Journal

Environment

البيئة

يوضح هذا الفيديو مقايسة تثبيط نمو الشتلات في نبات نبات ن يتم تحديد تأثير زيادة تركيز محفز الببتيد المناعي على نمو الشتلات.

قياس تثبيط نمو الشتلات الناجم عن المناعة

يسمح النظام المحفز للجذر الجانبي (LRIS) بالحث المتزامن للجذور الجانبية ويتم تقديمه ل نبات الأرابيدوبسيس الثاليانا والذرة.

الجانبي جذر النظام محرض في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; والذرة

&lt; p class = 'jove_content'&gt; تسهل البروتوكولات الموضحة هنا التحقيق المريح في استجابات الإيثيلين البكتيرية من خلال استخدام حمض 2-كلوروإيثيل فوسفونيك (CEPA).  يتم إنتاج الإيثيلين في الموقع من خلال تحلل CEPA في وسط نمو بكتيري مائي ، والتحايل على متطلبات غاز الإيثيلين النقي.

الاستفادة من مجمع بين الافراج عن الإثيلين، حمض 2-Chloroethylphosphonic، كأداة لدراسة استجابة الإثيلين في البكتيريا

ويدعم النظام كوكولتفاتيون المائية المائية النباتات سليمة مع شاشات شبكة معدنية وتزرع لهم البكتيريا. ويمكن بعد ذلك تحصين الأنسجة النباتية والبكتيريا والجزيئات التي تفرز بشكل منفصل لتحليل المصب، مما يسمح في وقت واحد للاستجابات الجزيئية من كل من المضيفين النبات والتفاعل الميكروبات أو الميكروبيوم ليتم التحقيق فيها.

نظام الزراعة المائية المشتركة للتحليل المتزامن والمنهجي للتفاعلات الجزيئية النباتية / الميكروبية والتشوير

البروتوكول الموضحة هنا طريقة لقياس اندوريدوبليكيشن داخل درنات البطاطس (البطاطا). أنه يتضمن خطوات استخراج بلاسموليسيس وجبلة مجردة لتقليل الضوضاء والحطام في تحليل سيتوميتريك تدفق المتلقين للمعلومات.

قياس اندوريدوبليكيشن بقياس التدفق الدرنات المعزولة بروتوبلاستس

هنا، نقدم بروتوكول لاستنفاد بشكل فعال وعلى وجه التحديد بروتين من الفائدة في الخميرة Saccharomyces سيريفيسياي باستخدام نظام بيتا-است AID.

ضبط التدهور لتحقيق استنفاد البروتين محددة وفعالة

نحن نقدم طريقة لتحديد المغيرات من نتح الأوراق من خلال فحص واسع النطاق لمكتبة مركبة.

تحديد المنظمين رواية نتح النبات من خلال فحص التصوير الحراري على نطاق واسع في Helianthus Annuus

هنا نحن وصف قوية anion تبادل عالية الأداء الكروماتوغرافيا السائلة من [3H]-ميو-الإينوزيتول- التسمية الشتلات التي هي طريقة حساسة للغاية للكشف عن وقياس البولي فوسفات إينوزيتول في النباتات.

استخراج واستخلاص كمي للذوبان, المشع الإينوزيتول بولي فوسفات من أنواع النباتات المختلفة باستخدام SAX-HPLC

تصف هذه الورقة طريقتين للتنميط الظاهري دون استخدام تقشير البشرة لتوصيف الجينات التي تتحكم في نمو الثغور. توضح الطريقة الأولى كيفية تحليل النمط الظاهري للثغور باستخدام بشرة نباتية زرقاء اللون بالتولويدين على شكل حرف O. تصف الطريقة الثانية كيفية التعرف على روابط الثغور ومراقبة أنشطتها البيولوجية.

تحديد الجينات المشاركة في تطور الثغور عن طريق تسجيل النمط الظاهري للبشرة

هنا ، نصف أداة متقدمة مصممة لمراقبة التخليق الحيوي للكلوروفيل خلال المراحل المبكرة من إزالة الشتلات من أرابيدوبسيس . توفر المنهجية الجديدة تصويرا غير جراحي مضان الكلوروفيل في الوقت الفعلي بدقة مكانية وزمانية عالية.

الفحص غير الجراحي لتحديد حركية التخليق الحيوي للكلوروفيل خلال المراحل المبكرة من إزالة التخليق من أرابيدوبسيس

اكتشف تحليل مستويات الأوكسين والسيتوكينين الذاتية بتقنية LC-MS/MS خلال تكوين البراعم العرضية في نبات عرق الذهب. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات تجديد الأنسجة النباتية بدقة عالية.

التحديد الكمي اكسين الذاتية وسيتوكينين خلال الثقافة Internode من عرق الذهب

استكشف المزيد من الفيديوهات