جيل بسيطة من ثقافة عالية الغلة المستحث الخلايا العصبية من الخلايا الليفية الجلد الكبار البشرية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توليد ثقافة عالية الغلة من الخلايا العصبية المستحثة من الخلايا الليفية الجلدية البشرية البالغة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الاضطرابات العصبية لأنها تسمح بتنكس الجهاز العصبي القائم على المريض الذي يحافظ على عمر الخلية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تسمح بتوليد الخلايا العصبية المستحثة من الأشخاص في أي عمر بطريقة موحدة وفعالة للغاية في 25 يوما فقط.

يسمح بمجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية ، بما في ذلك نمذجة الأمراض ، وعلم السموم ، والتشخيص ، بالإضافة إلى فحوصات فحص الأدوية على نطاق واسع جدا. سيظهر الإجراء شيلبي ، طالب دكتوراه داخل الوحدة التي يتدرب فيها الدماغ ، وكذلك كارلونيا ، في مختبرنا. للبدء ، قم بإذابة الخلايا الليفية الجلدية البشرية البالغة باستخدام نظام إذابة الخلايا الآلي.

بعد حساب رقم الخلية باستخدام عداد خلية آلي ، قم بزرع مائتي ألف خلية لكل قارورة T-75 تحتوي على 10 مل من وسط الخلايا الليفية. يحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، استبدل الوسط القديم بوسط الخلايا الليفية الطازجة.

استمر في تغيير وسط الخلايا الليفية كل ثلاثة إلى أربعة أيام حتى تصل الخلايا إلى 95٪ من التقاء. قبل ساعة من طلاء الخلايا الليفية الجلدية البشرية البالغة من إعادة البرمجة ، قم بتغطية كل بئر من صفيحة 24 بئرا ب 250 ميكرولتر من الجيلاتين 0.1٪. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية.

استنشق وسط الخلايا الليفية من القارورة ، واغسلها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco مرة واحدة. بعد الغسيل ، قم بتحلل الخلايا ب 1.5 مل من 0.05٪ التربسين لكل قارورة T-75 عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من وسط الخلايا الليفية لتحييد محلول التربسين.

قم بتبريد الخلايا المنفصلة في أنبوب سعة 15 مليلتر عن طريق طرد الخلايا الموجودة في القارورة مرتين. ثم قم بالطرد المركزي للخلايا عند 400 جم لمدة خمس دقائق. طرد المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من وسط الخلايا الليفية.

بعد ذلك ، قم بإعداد معلق خلوي من 1 ، 320 ، 000 خلية في 13.2 مل من وسط الخلايا الليفية من أجل تحقيق 100 ، 000 خلية لكل مليلتر من الوسط. بعد شفط الجيلاتين من الطبق ، اغسل الطبق بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco مرتين. ثم أضف 500 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر واحتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل.

دافئ 13.2 مل من الخلايا الليفية المتوسطة إلى 37 درجة مئوية. ثم قم بإذابة ناقل الفيروس في غطاء المحرك الصفحي في درجة حرارة الغرفة. أضف الحجم المطلوب من الفيروس العدسي اللازم لإصابة الخلايا الليفية الجلدية البشرية البالغة بعدوى متعددة تبلغ 20 إلى الوسط دون أي معززات للتنبيغ.

ثم استبدل الوسط ب 500 ميكرولتر من وسط الخلايا الليفية مع إضافة ناقل الفيروس العسسي. احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، يستعاض عن الوسط المحتوي على فيروس العدسات بوسط الخلايا الليفية الطازجة بدون ناقل الفيروسات العسسية.

في اليوم الثالث بعد نقل الفيروس ، قم بإزالة وسط الخلايا الليفية وأضف 500 ميكرولتر من وسط التحويل العصبي المبكر. مرتين أو ثلاث مرات في الأسبوع ، استبدل 225 ميكرولتر من الوسط القديم من كل بئر ب 250 ميكرولتر من وسط التحويل العصبي المبكر الطازج. في اليوم الثامن عشر بعد نقل الفيروس ، قم بإزالة وسط التحويل العصبي المبكر واستبدله ب 500 ميكرولتر من وسط التحويل العصبي المتأخر.

استمر في تغيير الوسيط كل يومين إلى ثلاثة أيام كما كان من قبل حتى اليوم الخامس والعشرين أو نقطة النهاية التجريبية. استخدم ماصة سعة 1000 ميكرولتر لإزالة الوسط. ثم أضف 250 ميكرولتر من عامل تفكيك الخلايا إلى كل بئر واترك اللوحة في الحاضنة لمدة 10 إلى 20 دقيقة حتى تنفصل الخلايا وتطفو كخلايا مفردة.

في غضون ذلك ، قم بإعداد المخزن المؤقت FACS. ثلاثي الأبعاد باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر. احتضن لفترة أطول قليلا إذا كانت هناك كتل خلاوية متبقية.

انقل معلق الخلية المفردة الذي تم الحصول عليه إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر. اغسل الآبار مرتين بوسط تحويل الخلايا العصبية المتأخرة وانقله إلى نفس أنبوب 1.5 ملليلتر. ثم ، جهاز الطرد المركزي عند 400 جم لمدة خمس دقائق وتخلص من السوبرانت.

بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. مرة أخرى ، قم بتدوير الخلايا عند 400 جم لمدة خمس دقائق وتخلص من السوبرنتنت. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS وجهاز الطرد المركزي.

كرر مرتين أخريين. بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على جسم مضاد CD56 البشري بتركيز واحد إلى 50 لمدة 15 دقيقة على الجليد ، بعيدا عن الضوء. الطرد المركزي للخلايا عند 400 جم لمدة خمس دقائق وقم بإذابة حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لغسل الخلايا.

مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 400 جم لمدة خمس دقائق. يغسل باستخدام عازلة FACS مرتين متبوعا بالطرد المركزي. أخيرا ، أعد تعليق 200 ميكرولتر من مخزن FACS الذي يحتوي على 10 ميكروغرام لكل مليلتر من يوديد البروبيديوم.

قم بفرز الخلايا الإيجابية NCAM والخلايا السلبية ليوديد البروبيديوم باستخدام البوابات على أساس مستوى شدة التألق لعينات التحكم التي لم يتم تلطيخها بالجسم المضاد NCAM أو يوديد البروبيديوم. استخدم عداد الخلايا الآلي لحساب عدد الخلايا وبذرة 50،000 خلية لكل سنتيمتر مربع على فيبرونيكتين Poly-L-ornithine ولوحة مطلية باللامينين مع وسط تحويل الخلايا العصبية المتأخرة. استمر في تغيير نصف الوسط مرتين إلى ثلاث مرات في الأسبوع باستخدام وسيط التحويل العصبي المتأخر حتى نقطة النهاية التجريبية.

تظهر صور تباين الطور التمثيلية التغيرات المورفولوجية في الخلايا خلال فترة التحويل. يظهر تحول كبير في التشكل الخلوي من اليوم الخامس. بحلول اليوم الثاني والعشرين ، تحولت ما يقرب من نصف الخلايا إلى خلايا عصبية.

تظهر صور التألق الأميني التمثيلية وجود علامات عصبية قياسية في الخلايا. بحلول اليوم الخامس والعشرين ، تحصل الخلايا على مورفولوجيا الخلايا العصبية وتعبر عن علامات عصبية مثل MAP2 و TAU. النوى ملطخة ب DAPI.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد الخلايا العصبية المستحثة من الخلايا الليفية البشرية البالغة. وهذا يشمل طلاء الخلايا لإعادة البرمجة ، ونقل الفيروس ، وصيانة الخلايا ، وكذلك فرز FACS للتنقية. يمهد تطوير هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الاضطرابات العصبية لدراسة السمات المختلفة المرتبطة بالمرض بالإضافة إلى العلاجات المحتملة.

ويمكن القيام بذلك في نظام ليس فقط نظاما عصبيا بشريا ولكن يمكن أن يكون خاصا بالمريض والمرض.