تصوير راتيوميتريك الكالسيوم من الخلايا العصبية الفردية في التصرف ايليجانس كاينورهابديتيس

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تصوير الكالسيوم النسبي لتأثيرات الخلايا العصبية المحددة للخنثى ، أو نشاط HSN ، على سلوك Caenorhabditis elegans. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب السلوكي حول كيفية إنتاج نشاط الدائرة العصبية لتغييرات في سلوك حيث تتناوب بين الحالات السلوكية. تسمح هذه التقنية بتسجيل التغييرات في نشاط الكالسيوم داخل الخلايا مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية ، مع تتبع سلوك وحركته في نفس الوقت.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للنشاط العصبي في C.elegans ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة نموذجية شفافة أخرى بما في ذلك ذبابة الفاكهة يرقات وأسماك الحمار الوحشي. يوضح الإجراء معي ، طلاب Collin's Labs: ريتشارد كوبكوك ، وبرافات داكال ، وليلى نصار. لتركيب ، قم أولا بتطبيق طعام بكتيري OP50 من صفيحة أجار متوسطة نمو الديدان الخيطية المصنفة إلى قاع معول دودة البلاتين واستخدم الانتقاء لنقل ما يقرب من 20 L متأخرا أربعة L-X 2 ، 000 للحيوانات التي تعبر عن مراسل الكالسيوم الحساس GCaMP5 و mCherry في HSN من محفز NL three P على صفيحة متوسطة لنمو الديدان الخيطية المصنفة.

تأكد من وجود الفرج النامي تحت المجهر المجسم كبقعة داكنة واضحة محاطة بهلال أبيض واحتضان الديدان عند 20 درجة مئوية لمدة 24-40 ساعة. في نهاية الحضانة ، ضع OP50 على معول جديد وانقل ثلاث ديدان إلى صفيحة متوسطة لنمو الديدان الخيطية غير المصنفة تاركا جزءا صغيرا من الطعام على الطبق الجديد لتتغذى عليه الديدان أثناء التصوير. بعد ذلك ، استخدم ملعقة مستديرة مسطحة لقطع قطعة 20 × 20 ملم من الصفيحة غير المزروعة ووضع القطعة ، الجانب الدودي لأسفل ، على حافة واحدة من غطاء نظيف 24 × 60 ملم رقم 1.5.

بعد ذلك ، حرك قطعة الأجار بحذر في وسط زلة الغطاء وضع زلة غطاء رقم واحد مقاس 22 × 22 ملم أعلى قطعة الأجار لتقليل الالتصاق والتبخر. لإعداد جهاز التصوير ، ضع الديدان على مسرح المجهر المقلوب وحدد 20x ذاتي. استخدم قطع العين المجهرية لتحديد دودة للتصوير وحرك مرشح الأشعة تحت الحمراء وضعه فوق المكثف.

افتح برنامج تحليل الفيديو المناسب وقم بتشغيل البرنامج النصي للاتصال النهائي للمرحلة التسلسلية XY. انقر فوق CsvWriter وحدد مجلدا لحفظ معلومات مرحلة X و Y المسجلة. ثم انقر فوق رأس السهم الأخضر لتهيئة ابتكار الاستحواذ الرقمي.

في برنامج تسجيل الكاميرا بالأشعة تحت الحمراء ضمن الإعدادات، حدد تبديل مربع حوار التحكم في الكاميرا. ثم حدد قائمة أوضاع الفيديو المخصصة وحدد الوضع 1 وتنسيق البكسل الخام ثمانية. ضمن Trigger Stroke، اضبط سطر إدخال Trigger على ثلاثة، والقطبية على عالية، والوضع على 14.

قم بالتبديل Enable لإيقاف الحصول على الإطار حتى يتم تلقي إشارة تشغيل الجهد من كاميرا الفلوريس. مع فتح نافذة عرض الصورة، انقر فوق تسجيل وحدد المجلد لحفظ تسلسلات الصور. حدد وضع التسجيل المخزن المؤقت واحفظ الصور بتنسيق JPEG.

ثم انقر فوق بدء التسجيل لتهيئة عملية الاستحواذ. بعد ذلك ، افتح علامة التبويب "الالتقط" في برنامج اكتساب الإزهار واضبط وقت التعرض على 10 مللي ثانية ، و Binning على أربعة X و Image Depth على 16 بت. حدد صفيف فرعي للكاميرا في المنتصف بعرض 512 بكسل وارتفاع 256 بكسل.

سيقوم البرنامج تلقائيا بتقسيم الصورة العريضة إلى نصفين لإنشاء قنوات الإزهار المنفصلة. انقر فوق إظهار خيارات مشغل الإخراج، وقم بتعيين جميع المشغلات إلى إيجابية. تأكد من تعيين المشغل الأول والمشغل الثاني على التعريض الضوئي وتم تعيين المشغل الثالث على قابل للبرمجة بفترة 25 مللي ثانية.

بعد ذلك ، ضمن علامة التبويب التسلسل ، حدد الفاصل الزمني ضمن إعدادات المسح الضوئي ، اضبط تأخير الحقل مرة واحدة إلى 50 مللي ثانية لجمع الصور بتردد 20 هرتز. حدد حفظ في مخزن مؤقت مؤقت. بالنسبة لتصوير الكالسيوم النسبي، ضمن علامة التبويب التسلسل، انقر فوق ابدأ لبدء تسجيل الدودة وتتبعها باستخدام عصا التحكم مع الحفاظ على الخلايا والمشابك ذات الاهتمام في مركز مجال الرؤية.

في اللحظة التي يبدأ فيها تسجيل الإزهار ، يتم إرسال المشغلات إلى كاميرا المجال الساطع المنتظرة ووحدة التحكم في المسرح التي تبدأ في جمع الصور المتزامنة وموضع المسرح. انقر على زر الإحصائيات في نافذة الرسم البياني لعرض إحصائيات البكسل لكل قناة. اضبط طاقة LED لضمان الحد الأقصى لبكسل واحد من إزهار mCherry عند الطرف قبل المشبكي أكبر من أو يساوي 8,000 عدد في القناة الحمراء مما يعطي نطاقا ديناميكيا يبلغ حوالي 12 بت فوق الخلفية.

تكون إشارات مراسل الكالسيوم في الطرف قبل المشبكي أثناء الراحة أو انخفاض الكالسيوم حوالي 2،500 عدد في القناة الخضراء. سجل السلوك حتى يتم الوصول إلى حالة نشطة وضع بيضة واحدة. بعد ذلك ، احفظ مجموعة فرعية مدتها 10 دقائق تحتوي على 6،000 إطار قبل و 6،001 إطار بعد حدث وضع البيض الأول.

احرص على الاحتفاظ بنفس المجموعة الفرعية من صور المجال الساطع لسلوك الدودة والنقاط الزمنية لموضع مرحلة XY وإلا ستفقد المزامنة الدقيقة لتدفقات البيانات. بالنسبة لتجزئة الصور ، قم باستيراد تسلسلات الصور إلى برنامج Ratiometric Quantization Software المناسب وانقر بزر الماوس الأيمن على السلسلة الزمنية في علامة تبويب التسلسل لضبط السلسلة الزمنية على 20 إطارا في الثانية و 1.25 ميكرومتر لكل بكسل. ضمن قائمة الأدوات ، حدد نسبة ثم حدد mCherry للقناة A و GCaMP5 للقناة B وانقر فوق حساب لطرح الخلفية من كل تسلسل صورة.

حدد تطبيق جدول بحث قوس قزح على قناة النسبة واستخدم قناة mCherry لإنشاء قناة نسبة معدلة الشدة لتعيين لون النسبة على سطوع قناة mChery. انقر فوق النسبة لإنشاء القناتين. لإنشاء بروتوكول للبحث عن الكائنات ، اسحب أداة البحث عن الكائنات باستخدام الكثافة ضمن علامة تبويب القياسات إلى جزء البروتوكول وانقر فوق الترس لتعيين نافذة قيم كثافة mCherry والبحث عن الكائنات.

حدد قيم الشدة أكبر من أو تساوي انحرافين معياريين أعلى الخلفية مع الحرص على اكتشاف جسم الخلية ونهاية ما قبل المشبكي. أضف أي مرشحات إضافية تستهدف قناة mCherry فقط عند الضرورة لاستبعاد الكائنات غير المرغوب فيها ، مثل: الرأس أو الذيل أو الإزهار الأمعاء. ثم افتح قائمة القياسات وحدد جعل عنصر القياس واختر جميع النقاط الزمنية لتنفيذ بروتوكول تحليل تكميم الصورة.

يتم استخدام الاستحواذ المتزامن على إشارات الإزهار GCaMP5 و mCherry لإنشاء قناة نسبة بكسل تلو الأخرى تعوض عن التغيرات في حركة وتركيزه. لكل ، يمكن أن ترتبط التغييرات في كالسيوم HSN داخل الخلايا قبل المشبكي بالسلوكيات الواضحة في تصوير المجال الساطع بما في ذلك إطلاق البويضات والتغيرات في الحركة. في الواقع ، يمكن ملاحظة اختلافات كبيرة في سرعة الدودة قبل وأثناء وبعد الحالة النشطة لوضع البيض.

يكشف التكبير في حدث وضع البيض عن تغيير قوي في إزهار GCaMP5 قبل حدث وضع البيض. بينما يظل إزهار mCherry دون تغيير نسبيا. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر التغييرات المقاسة في نسبة GCaMP5: mCherry بوضوح عابر كالسيوم HSN قبل حوالي 4 ثوان من إطلاق البويضة.

يؤدي تقلص عضلة الفرج إلى ما يتضح من التباطؤ الواضح في حركة الدودة التي تنتهي بإطلاق البويضات. علاوة على ذلك ، يسمح تصوير الديدان وتتبعها كما هو موضح للتو بتصور التنظيم المكاني لسلوك وضع البيض من البحث عن الطعام ، وتغيرات الكالسيوم HSM العابرة ، ونشاط HSN الذي ينتقل إلى إطلاق النار قبل الحركة إلى موقع وضع البيض. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ساعة أو ساعتين ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على التركيز على الخلايا ذات الأهمية وأطرافها قبل المشبكية أثناء خطوات التصوير. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التنشيط البصري الوراثي للإجابة على أسئلة إضافية حول كيفية استجابة HSN للتحفيز قبل المشبكي. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف وظيفة دائرة وضع البيض في C.elegans.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تصوير الكالسيوم النسبي ل HSN في Caenorhabditis النشط.