استخدام نظام إثراء إيمونوبريسيبيتيشن شاملة لتحديد ملف تعريف تعديل بوستترانسلاشونال ذاتية للبروتينات المستهدفة

الهدف العام لهذا البروتوكول التجريبي هو تمكين محققي PTM عديمي الخبرة من تحديد ما إذا كان البروتين المستهدف قد تم تعديله داخليا بواسطة واحد أو أكثر من PTMs باستخدام نظام شامل واحد. ستعزز هذه الطريقة التحقيق في مجال التعديل اللاحق للترجمة من خلال تمكين الكشف عن PTMs الرئيسية والحديث المتبادل المحتمل لأي بروتين مستهدف باستخدام نظام واحد مبسط. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخبراء غير التابعين ل PTM يمكنهم اكتشاف ما إذا كان البروتين قد تم تعديله داخليا بواسطة واحد أو أكثر من PTMs في نظامهم النموذجي.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة أثناء دراسة الآليات التنظيمية للعديد من مسارات إشارات الخلية ، واكتشفنا أن مجموعاتنا أو أنظمتنا سهلة الاستخدام لم تكن متاحة حقا لدراسة PTMs غير الفوسفو. ابدأ هذا الإجراء بإعداد خلايا A431 ، كما هو موضح في بروتوكول النص. أيضا ، قم بإعداد تحلل الناسف في مخازن التخفيف مع المثبطات.

اسكب وسائط الثقافة ، وضع الخلايا على الجليد. ثم اغسل الخلايا مرتين ب 10 ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBS قبل إضافة المخزن المؤقت لتحلل الناسف لزيادة تحلل الخلايا.

أضف 600 ميكرولتر من محلول تحلل الناسف إلى كل لوحة 150 ملم. تعتمد كمية المخزن المؤقت على إنتاجية البروتين المتوقعة. بعد ذلك ، قم بتحليل الخلايا باستخدام مكشطة الخلايا.

سيصبح المحلل لزجا بسبب التحلل النووي. استخدم طرف ماصة مقطوعة بحجم ملليمتر واحد لنقل المحللة الخام إلى مرشح مكبر تم وضعه في أنبوب تجميع سعة 15 ملليلترا. استخدم مكبس المرشح المرفق لضغط مرشح الناسف بالكامل ، وجمع تدفق المحللة ، بما في ذلك أي فقاعات ، في أنبوب سعة 15 مل.

يزيل مرشح الناسف البسيط والفعال الحمض النووي الجيني ، بدلا من قصه كما هو موضح في الطرق الأخرى شائعة الاستخدام. قم بتخفيف المحللة المصفاة باستخدام المخزن المؤقت لتخفيف الناسف إلى الحجم النهائي البالغ ثلاثة ملليلتر لكل لوحة 150 ملم. يعتمد الحجم النهائي على إنتاجية البروتين المتوقعة.

هذه الخطوة مهمة ، حيث ستؤثر التركيبة النهائية للمخزن المؤقت على صرامة تفاعل الترسيب الأميني. بعد ذلك ، قم بإعداد مقايسة كمية البروتين ، كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بقياس امتصاص عينة المحللة عند 600 نانومتر ، واحسب تركيز البروتين.

اقلب أنبوب كاشف المخزون عدة مرات للتأكد من تعليق الخرزات تماما في الأنبوب. لكل اختبار IP ، قم بتقسيم تعليق الخرزة إلى أنابيب طرد مركزي صغيرة منفصلة سعة 1.5 مل على الجليد. هنا ، أضف 20 ميكرولترا من حبات تقارب اليوبيكويتين ، أو 30 ميكرولترا من حبات تقارب الفوسفوتيروزين ، أو 40 ميكرولترا من حبات التقارب SUMOylation 2/3 ، أو 50 ميكرولتر من حبات تقارب الأسيتيل إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الفردية.

اقلب أنابيب كاشف المخزون التي تحتوي على حبات التحكم في IP في كل مكان وخرز التحكم IGG عدة مرات للتأكد من إعادة تعليق الخرزات بالكامل في الأنبوب. بعد ذلك ، قم بتقسيم حبات التحكم لكل تفاعل تحكم لتحديد الارتباط غير المحدد. هنا ، أضف 20 ميكرولترا من حبات التحكم في اليوبيكويتين ، أو 30 لترا صغيرا من حبات التحكم في الفوسفوتيروزين ، أو 40 ميكرولترا من حبات التحكم SUMOylation 2/3 ، أو 50 ميكرولترا من حبات التحكم في الأستلة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الفردية سعة 1.5 ملليلتر على الجليد.

وفر 20 ميكرولترا من المحللة لتشغيلها كعنصر تحكم في محللات إدخال اللطخة الغربية. أضف خمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت للعينة 5x إلى المحللة المحجوزة واتركها تغلي على حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف المحللة إلى كل أنبوب IP وأنبوب IP للتحكم فيه.

هنا ، تم استخدام ملليغرام واحد من المحللة لكل تفاعل IP والتحكم ، مما أدى إلى ما مجموعه ثمانية تفاعلات IP. احتضان الأنابيب على منصة دوارة ودوارة عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، اجمع الخرزات عن طريق الطرد المركزي عند ثلاثة إلى 5 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية.

استنشق أكبر قدر ممكن من المواد الطافية دون إزعاج الخرزات ، ثم اغسل الخرزات في مليلتر واحد من مخزن غسيل الناسف لمدة خمس دقائق على منصة دوارة بأربع درجات مئوية واجمع الخرزات عن طريق الطرد المركزي كما كان من قبل. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط أكبر قدر ممكن من المواد الطافية دون إزعاج الخرزات وكرر خطوة الغسيل مرتين أخريين. بعد الغسيل النهائي والطرد المركزي ، استنشق الغالبية في المادة الطافية العازلة ، ثم قم بإزالة المادة الطافية المتبقية باستخدام طرف تحميل البروتين ذو التجويف الدقيق.

الحد الأدنى من تعطيل حبة حبة مقبول. تأكد من إزالة كل المخزن المؤقت للغسيل مع تقليل تعطيل حبيبات النبض من أجل تحقيق أقصى قدر من استعادة بروتينات PTM. بعد ذلك ، أضف 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت لشطف الخرزة وأعد تعليق الخرزات عن طريق النقر برفق على جانب الأنبوب أو النقر عليه.

لا تستخدم الماصة في هذه المرحلة. احتضان الخرزات المعلقة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. قم بقص طرف طرف ماصة النقل وانقل كل معلق حبة برفق إلى عمود دوران لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر تم وضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

الطرد المركزي للعينة بين تسعة و 10 ، 000 مرة G من دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة لجمع عينة IP ، ثم أضف ميكرولترين من 2-mercaptoethanol إلى كل عينة واخلطها جيدا. ضع العينات في حمام مائي 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة ، اجمع العينة عن طريق الطرد المركزي عند 10،000 مرة G لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

أخيرا ، انتقل إلى تشغيل SDS PAGE ، والنقل ، وتحليل اللطخة الغربية كما هو موضح في بروتوكول النص. تمت إضافة محللة خلية A431 غير المعالجة والمعالجة ب EGF إلى حبات تقارب اليوبيكويتين والفوسفوتيروزين و SUMO 2/3 و acetyl lysine. تم استخدام الجسم المضاد PD-L1 لتحليل اللطخة المناعية الغربية لتحديد ما إذا كان بروتين PD-L1 قد تم تعديله بواسطة هذه PTMs الأربعة استجابة لتحفيز EGF.

تشير النتائج التمثيلية الموضحة هنا إلى أن هذه الطريقة تحدد بشكل فعال تعديلات PTM الداخلية ل PD-L1. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أربع إلى 4 ساعات ونصف إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اكتشاف PTM أو الحديث المتبادل للبروتين المستهدف أو مسار الإشارات باستخدام نظام الكشف الشامل عن PTM هذا.