الفرز على نطاق الجينوم [رني] تحديد العوامل المضيفة التي تعدل علاج فيروس أونكوليتيك

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد أهداف المضيف التي يمكن التلاعب بها لتعزيز العلاج بفيروس حال الأورام. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال العلاج بفيروس حال للأورام ، مثل عوامل المضيف المحددة والمسارات الخلوية التي تعدل تكاثر الفيروس حال للأورام. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح للمرء بتحديد أهداف المضيف التي يمكن التلاعب بها لتعزيز العلاج بفيروس حال للأورام بطريقة شاملة وغير متحيزة.

يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لتحديد عوامل المضيف التي تعدل تكرار الفيروس بشكل عام. بعد تطوير اختبار فحص عالي الإنتاجية وفقا لبروتوكول النص ، قم بإزالة مجموعة من ألواح الميكروتيتر من الفريزر واتركها تذوب لمدة 20 إلى 30 دقيقة. في غضون ذلك ، املأ زجاجتين بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم املأ أنبوبين مخروطيين سعة 50 مل ب PBS وواحد بالماء المقطر.

اغمر أنبوب موزع السائل في زجاجة تحتوي على 70٪ من الإيثانول ثم ضع قطعة من الشريط اللاصق حول الأنبوب لتحديد النقطة التي يمكن أن يعتبر الأنبوب معقما تحتها. استخدم ما يقرب من 25 مل من 70٪ من الإيثانول لتجهيز الأنبوب. صب المزيد من الإيثانول في الزجاجة لتعويض الحجم المفقود ، ثم اترك الأنبوب في الإيثانول لمدة خمس دقائق على الأقل.

بعد تحضير غطاء زراعة الخلايا ، قم بالطرد المركزي للألواح المختومة وضبطها على 1026 مرة G في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بإزالة الأختام من اللوحات. ثم قم بإدخال الماصة الكمية المطلوبة من كاشف التعدي في الأنابيب المخروطية التي تحتوي على كاشف التعداء المخفف مسبقا.

ابدأ في تربسين الخلايا عن طريق شفط الوسط من كل لوحة. استخدم تسعة مل من PBS لشطف الخلايا ، ثم ماصة ثلاثة مل من التربسين لكل طبق. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تقريبا.

بعد ذلك ، استخدم 22 مل من الوسط لإعادة تعليق الخلايا الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات. اجمع معلق الخلية من كل لوحة زراعة أنسجة في زجاجة معقمة واخلط معلق الخلية عن طريق قلب الزجاجة. ثم قم بعمل ماصة مل واحد من الأليكوات في تعليق الخلية إلى أنبوبين منفصلين من الطرد الدقيق.

قم بإزالة العينة من كل أنبوب ميكروفوج واحسب الخلايا. ثم احسب حجم تعليق الخلية المطلوب للكثافة المطلوبة ، وقم بإعداد ما يكفي من تعليق الخلية المخفف للتوزيع عبر دفعة واحدة من الألواح. أثناء تحضير الخلايا ، أفرغ أنبوب موزع السائل من الإيثانول.

استخدم ما يقرب من 25 مل من PBS لتجهيز الأنبوب ، ثم قم بإفراغ الأنبوب. تأكد من أن جزء الأنبوب الذي سيتم غمره في كاشف التعداء ، ولاحقا في تعليق الخلية ، يبقى معقما. قم بفصل الألواح التي يمكن إجراؤها بأمان باستخدام أنبوب مخروطي واحد من محلول كاشف التعداد.

ماصة محاليل كاشف النفدة لأعلى ولأسفل 10 مرات. ثم استخدم المحلول لتجهيز الأنبوب قبل توزيع 5 ميكرولتر لكل بئر. الطرد المركزي الألواح عند 1026 مرة G في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.

ثم احتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة للوقت المحدد لاستخدام كاشف التعداد. أثناء الحضانة ، أفرغ أنبوب محلول كاشف الإرسال وضعه في أنبوب مخروطي كامل سعة 50 مل يحتوي على PBS. ثم استخدم ما يقرب من 25 مل من PBS لشطف الأنبوب عن طريق التحضير ثم إفراغه.

امزج الزجاجة التي تحتوي على تعليق الخلية ، ثم ضع الأنبوب في التعليق وقم بتجهيز الأنبوب بما يكفي لترى أن كل طرف يتم توزيعه بشكل صحيح. قم بتوزيع 30 ميكرولتر لكل بئر من تعليق الخلية عبر جميع الألواح. أفرغ معلق الخلية من الأنبوب ، ثم اشطف الأنبوب بحوالي 25 مل من PBS متبوعا بحوالي 50 مل من الماء المقطر.

اترك الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 إلى 60 دقيقة من وقت بذر الخلايا. ثم احتضان الألواح في حاضنة غير مضطربة للطول المطلوب لإسكات الجينات. لتوفير الوقت ، في اليوم السابق لإصابة الخلايا ، قم بوضع الماصة في زجاجات معقمة الكمية الدقيقة من الوسط المطلوب لإصابة كل دفعة من الألواح ، بما في ذلك الوسط للآبار غير المصابة.

قم بتسخين الوسط عند 37 درجة مئوية ، ثم املأ زجاجتين بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وأنبوبين مخروطيين سعة 50 مل مع PBS ، وواحد بالماء المقطر. تعقيم الأنبوب بنسبة 70٪ من الإيثانول كما هو موضح سابقا. أثناء وجود الأنبوب في الإيثانول ، قم أولا بدوامة الفيروس ثم قم بتقطيع الحجم الدقيق للفيروس المطلوب في زجاجة وسط العدوى.

ثم اشطف الأنبوب باستخدام 25 مل من PBS لتجهيزه ، ثم أفرغه. بعد إزالة الألواح من الحاضنة ، ضعها في غطاء مزرعة الأنسجة. استخدم وسيطا لتجهيز الأنبوب ، ثم قم بتوزيع 40 ميكرولترا من الوسط في آبار التحكم غير المصابة.

أفرغ الأنبوب من الوسط ، واستخدم 25 مل من PBS لشطفه. بعد خلط الفيروس ، ضع الأنبوب في الزجاجة التي تحتوي على الفيروس ، وقم بتوزيع 40 ميكرولترا من الفيروس عبر اللوحات. قم بالطرد المركزي للألواح عند 400 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

احتضان الألواح للمدة الزمنية المحددة مسبقا. في اليوم السابق للتثبيت ، قم بإعداد زجاجة من محلول التثبيت والوقوف الذي يحتوي على أربعة بالمائة من الفورمالديهايد و PBS لكل دفعة من الألواح ، ولكن احذف بقعة Hoechst. قم بتخزين المحلول في الخزانة القابلة للاشتعال بعيدا عن الضوء.

في اليوم التالي ، استخدم 70٪ من الإيثانول و PBS لشطف الأنبوب كما هو موضح سابقا. وزعي 30 ميكرولترا من المحلول على جميع الألواح ، ثم ضع الأطباق في الحاضنة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، ضع الأختام على الألواح وقم بتخزينها على أربع درجات مئوية محمية من الضوء.

إجراء التصوير والتحليل وفقا لبروتوكول النص. تظهر هنا 786 خلية O ملطخة ب Hoechst 33342 بعد حضانة لمدة 72 ساعة مع كاشف تعدي مخفف وحده. كاشف الإرسال والمخفف غير المستهدف siRNA ، ومع siRNA الذي يستهدف PLK1.

تشير مخططات البقاء على قيد الحياة التي تظهر هنا إلى أن 22٪ من الخلايا التي تم نقلها باستخدام PLK1 siRNA نجت ، و 94٪ من الخلايا التي تم نقلها باستخدام siRNA غير المستهدف. يصور هذا الرسم البياني نتائج المسار الزمني المباشر ل 786 خلية O مصابة بفيروس اللقاح حال للأورام التي تعبر عن GFP المعزز في مختلف سبل الداخل. يتم عرض الصور التمثيلية للخلايا المصابة في وزارة الداخلية 0.05 خلال دورة زمنية حية هنا.

ستسمح فترة الحضانة التي تبلغ 21 ساعة باكتشاف الزيادات والانخفاضات في الانتشار لأن النقطة الزمنية تقع ضمن نطاق خطي. بعد فحوصات RNAi على مستوى الجينوم عبر ثلاثة خطوط خلايا سرطانية ، تم تحديد 1008 ضربة مشتركة بين اثنين على الأقل من أصل ثلاثة خطوط خلايا سرطانية باستخدام طريقة MAD. تم اختيار 10 ضربات ضمن مسارات الاستعراض الدوري الشامل و ERAD للتحقق الثانوي عبر siRNA بتسلسلات استهداف مختلفة.

عند الاستغناء عن الكواشف ، من الأهمية بمكان أن يكون لديك الدفعة الصحيحة من الألواح ، وأن تكون قد حددت الحجم الصحيح للتوزيع ، وأن يكون الأنبوب مملوءا بالكاشف الصحيح وأن يكون دائما مغمورا بالكامل في الكاشف. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء شاشة RNAi عالية الإنتاجية لتحديد أهداف المضيف التي يمكن التلاعب بها لتعزيز العلاج بفيروس حال للأورام ، أو لتحديد العوامل المضيفة التي تعدل تكاثر الفيروس بشكل عام.