خلية "التجميع فحوصات" لتقييم ربط الشق المورفولوجية مع ترانس-يغاندس وتثبيط عن طريق رابطة الدول المستقلة-يغاندس

الهدف العام من مقايسة التجميع هذه هو تقييم ارتباط مستقبلات الشق مع الروابط العابرة وتثبيطها بواسطة روابط رابطة الدول المستقلة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على سؤال رئيسي ، كيف سيؤثر العامل الوراثي أو الدوائي على ارتباط مستقبل الشق بالترابط الخاص به ، وتغيير الإشارات؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتقييم الارتباط العابر ورابطة الدول المستقلة لمستقبلات Notch مع الترابط الخاص به.

ومن المثير للاهتمام ، دون إشراك التأثير المتداخل للترابط الداخلي. ابدأ التقييم عن طريق تدوير الخلايا المستقبلة للإشارة وإعادة تعليقها في وسيط شنايدر. عد الخلايا يدويا باستخدام مقياس الدم.

صفيحة خمسة في 10 إلى الخامسة S2 ومستقرة S2-Notch الخلايا في كل بئر من صفيحة ستة آبار ، في ملليلتر واحد لكل بئر من شنايدر متوسط. بعد ذلك ، أضف 7.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المزدوج الشريطة إلى كل بئر ، واحتضن الخلايا عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. أضف 0.7 ملليمولار من كبريتات النحاس للحث على التعبير عن الشق ، واحتضان الخلايا عند 25 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام.

بعد الحضانة ، عد الخلايا المرسلة للإشارات يدويا باستخدام مقياس الدم. ولوحة خمسة في 10 إلى الخلايا المستقرة السادسة في كل بئر من صفيحة مكونة من ستة آبار ، في مليلتر واحد لكل بئر من وسط شنايدر المكملة. ثم أضف 0.7 ملليمولار من كبريتات النحاس للحث على التعبير عن الروابط ، واحتضان الخلايا عند 25 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.

احصد خلايا S2-control و S2-Notch المعالجة بالحمض النووي الريبي المزدوجة التي تقطعت بها السبل عن طريق سحب العينة اللطيف. والصفيحة 2.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر في صفيحة 24 بئرا. أضف خمسة أضعاف 10 إلى خلايا الطماطم المستقرة الخامسة S2-Delta أو S2-Serrate إلى الحجم الإجمالي البالغ 200 ميكرولتر من وسط شنايدر المكمل.

ضع اللوحة على شاكر مداري عند 150 دورة في الدقيقة. بعد دقيقة واحدة ، اخلطي محتويات كل بئر ، وأخرجي 20 ميكرولترا لحساب عدد الركام. في الوقت نفسه ، التقط صورة تمثيلية تحت مجهر مركب مقلوب باستخدام تكبير 10x.

لتصور الخلايا ، اضبط الكاميرا على المجهر ، واتصل بالبرنامج للحصول على الصورة. عد الركام يدويا باستخدام مقياس الدم. ضع الطبق على شاكر.

كرر الحصول على الصورة والعد بعد خمس دقائق و 15 دقيقة من التجميع. قم بإجراء القياس الكمي عبر الربط عن طريق حساب عدد الركام لكل مليلتر بين خلايا S2 وخلايا S2-Delta أو S2-Serrate Tomato كعنصر تحكم في الخلفية ، وعدد الركام لكل مليلتر بين خلايا S2-Notch و S2-Delta أو S2-Serrate Tomatoes. قم بإعداد الخلايا المستقبلة للإشارة عن طريق الطلاء خمس مرات من 10 إلى خلايا S2 الخامسة في كل بئر من صفيحة مكونة من ستة آبار ، في مليلتر واحد لكل بئر من وسط شنايدر المكمل.

أضف 7.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المزدوج الشريطة إلى كل بئر ، واحتضن اللوحة عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة ، قم بنقل الخلايا المعالجة بالحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة للحصول على تركيز إجمالي للحمض النووي يبلغ ميكروغرامين لكل بئر باستخدام كاشف تعداء تجاري. احتضان خلايا S2 المنقولة عابرة عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

في اليوم التالي ، أضف 0.7 ملليمولار من كبريتات النحاس للحث على التعبير عن الشق والروابط ، واحتضن عند 25 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. إعداد خلايا إرسال الإشارات كما هو موضح في القسم السابق. وأخيرا ، قم بإجراء التجميع بين خلايا إرسال الإشارات واستقبال الإشارات ، كما هو موضح سابقا.

لوحظت زيادة حادة في عدد الركام بين دقيقة وخمس دقائق. ثم استمر عدد الركام في الزيادة حتى 30 دقيقة ، بمعدل أبطأ. توضح الصور التي تظهر التجميع في ثلاث نقاط زمنية أن خلايا S2-Notch المعالجة بالحمض النووي الريبي المزدوجة التي تقطعت بهم السبل من EGFP شكلت مجاميع مع خلايا S2-Delta ، والتي يزداد عددها بمرور الوقت.

في المقابل ، شكلت خلايا S2-Notch المعالجة بالحمض النووي الريبي المزدوجة التي تقطعت بهم السبل مجاميع بشكل أسرع ، وكانت الركام أكبر وأكبر في العدد. مشيرا إلى أن انخفاض مستويات الوسادة عزز الارتباط العابر للشق مع دلتا. يؤدي نقل كميات متساوية من تركيبات تعبير Notch و Delta إلى خلايا S2 إلى تقليل عدد الركام المتكونة بين هذه الخلايا وخلايا S2-Delta بشكل كبير.

علاوة على ذلك ، يؤدي تقليل كمية دلتا رابطة الدول المستقلة إلى زيادة في عدد المجاميع. مشيرا إلى أنه في نطاق نسب Notch / cis-Delta المستخدمة في هذه المقايسات ، يمكن لرابطة الدول المستقلة دلتا أن تمنع الارتباط بين Notch و trans-Delta بطريقة تعتمد على الجرعة. أظهر القياس الكمي للتجميع النسبي تثبيطا مماثلا للتجميع عند علاج الحمض النووي الريبي المزدوج EGFP و shams.

بمجرد تحضير جميع الكواشف ، يصبح هذا الاختبار مباشرا ويمكن تنفيذه في غضون ساعات قليلة.