عالية الدقة حجم التصوير من الخلايا العصبية باستبعاد استخدام Fluorescence الأسلوب وكرست أجهزة موائع جزيئية

الهدف العام من هذا الإجراء هو السماح بقياس المجال الكامل لحجم الخلايا العصبية في المختبر بدقة محورية دون ميكرومترية مطلوبة لتحليل الخلايا العصبية في الهياكل الديناميكية الضمنية في نمو الخلايا العصبية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب الخلوي فيما يتعلق بديناميكيات تغيرات الحجم على النطاق الفرعي أثناء عدم النمو أو تنكس المحور العصبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر دقة محورية دون الميكرومترية جنبا إلى جنب مع المراقبة الكاملة والمقياس الزمني لساعات أو أيام.

لبدء الإجراء ، قم بإزالة كتلة PDMS تحت غطاء كيميائي عن طريق صب الأيزوبروبانول عليها. بعد ذلك ، ضعه على مقعد الغطاء المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ. قم بقص رقاقة السيليكون وقم بإزالة نسخة طبق الأصل PDMS.

ثم قم بقص الرقاقة واترك هامشا بحجم ملليمترين باستخدام مشرط أو شفرة حلاقة. قم بثقب المدخل عن طريق الضغط على أداة الثقب التي يبلغ قطرها 1.5 ملم بقوة وقم بتشغيلها لقطع ونحت ثقب المدخل. افعل الشيء نفسه في المناطق الأربع المخصصة للشريحة حيث سيتم حقن السائل.

بعد ذلك ، قم بتنظيف الرقاقة عن طريق لصق وتقشير الشريط اللاصق على الجانب المجهري. يرش الأيزوبروبانول على كلا الجانبين. ثم جفف الرقاقة بالنيتروجين المضغوط باستخدام مسدس نفخ الهواء.

في هذا الإجراء ، ضع كل غطاء على مغطي دوار يقع في بيئة غرفة نظيفة. ضع قطرة من المقاومة الضوئية الإيجابية لتغطية حوالي 75٪ من الغطاء والطبقة الدورانية عند 4000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية للوصول إلى سمك نهائي يبلغ 0.45 ميكرومتر. ضع الغطاء على لوح تسخين بدرجة حرارة سطح 115 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.

باستخدام مقويم القناع ، قم بتعريض كل غطاء بطول موجي يبلغ 435 نانومتر من خلال القناع المخصص وفقا لمعلمات المصنع. بعد ذلك ، قم بإعداد طبقين من الزجاج المتبلور ، أحدهما يحتوي على المطور بدون تخفيف ، والآخر يحتوي على ماء منزوع الأيونات. اغمس الأغطية واحدة تلو الأخرى في المطور لمدة دقيقة واحدة مع تحريك الطبق المتبلور باستمرار وبلطف.

ثم اغمر الرقاقة في ماء منزوع الأيونات لمدة خمس ثوان تقريبا. انقل الرقاقة إلى ورق ماص وجففها بالنيتروجين المضغوط باستخدام مسدس نفخ الهواء. ضع كل من شريحة PDMS والطبق الزجاجي الذي سيتم ربطه به في غرفة البلازما لتنشيط السطح.

بعد ذلك ، قم بإيداع قطرة ماء على شريحة زجاجية مجهرية سميكة مستطيلة وألصق الغطاء على الشريحة الزجاجية بواسطة الشعيرات الدموية. تحت المجهر ، حدد موقع خطوط مقاومة الضوء في الجزء الخلفي من الشريحة الزجاجية. ضع الغطاء الزجاجي المزخرف على حامل القناع الخاص بمقمص القناع.

اعتمد على العلامة التي تم إجراؤها لتوسيط الكائنات المرجعية المقاومة للضوء. لزيادة التباين البصري ، ضع رقاقة السيليكون أسفل شريحة PDMS. يجب أن تظل رقاقة السيليكون متصلة بإحكام على الظرف أثناء عملية المحاذاة.

ثم ضع شريحة PDMS على حامل الركيزة المتنقل لمصفف القناع. بعد ذلك ، ارفع ظرف الظرف بما يكفي لتصور كل من الشريحة ومجموعة الخطوط المقاومة للضوء الموجودة على الغطاء مع البقاء خلف التلامس الميكانيكي. قم بإجراء المحاذاة وتحقيق التلامس الميكانيكي بين الشريحة والغطاء عن طريق رفع الظرف حتى يلامس سطح أعمدة PDMS زلة الغطاء الزجاجي.

بعد ذلك ، اخفض الظرف. قم بإزالة الغطاء المرتبط بالشريحة من حامل القناع. بعد ذلك ، ضع الجهاز في طبق بتري مقاس 35 ملم وانقل كل شيء إلى الفرن لمدة خمس إلى عشر دقائق لزيادة قوة الترابط.

بعد ثلاثين دقيقة من الترابط ، ضع طرف ماصة سعة عشرة ميكرولتر مملوءة بمحلول PLO عند المدخل. ثم قم بتحميل السائل حتى يتكون قطرة في الأعلى. كرر نفس العملية في المخرج والخزانات.

بعد ذلك ، أضف PBS في طبق Petri في جميع أنحاء الشريحة. أغلق طبق بتري بغشاء البارافين واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس ساعات على الأقل. بعد ذلك ، اضغط على مخروط طرف سعة عشرة ميكرولتر برفق في كل فتحة حقن وامتص السائل الزائد.

بعد ذلك ، استبدل PLO وكذلك PBS المحيط بالشريحة بوسط الاستزراع. بعد ذلك ، ضع الشريحة في الحاضنة المنظمة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تزرع الخلايا العصبية بوقت حضانة لا يقل عن خمس ساعات. في هذا الإجراء ، ارسم وسط الثقافة من الشريحة.

اجمع ليلترين إلى ثلاثة ميكرولتر من محلول الخلية المعلق حديثا وحقنها عند المدخل. كرر نفس العملية على الفور في المخرج. حقن نفس الحجم تقريبا من وسط الاستزراع في كل خزان.

راقب بسرعة الشريحة الموجودة تحت المجهر للتحقق من كثافة الخلايا. يتوافق ترتيب حجم كثافة الخلية المثلى مع حوالي خمس إلى عشر خلايا داخل السطح المربع المحدد بأربعة أعمدة. كرر إجراء حقن 0.5 إلى 1 ميكرولتر من معلق الخلية للوصول إلى كثافة الخلية المستهدفة.

للتصوير ، استبدل وسط الثقافة بوسيط التصوير. ثم ضع الشريحة تحت مجهر epifluorescence. الحصول على صور للخلايا من صور متتالية مفردة إلى متعددة في حالة تجارب الفاصل الزمني.

تظهر هنا الملاحظات التمثيلية لشريط معايرة مقاومة للضوء والخلايا العصبية. يتم عرض صور التكبير الأعلى والمقاطع العرضية لهذه الكائنات على اليمين. تظهر هنا العصبية التمثيلية والغرفة المركزية التي يبلغ ارتفاعها ثلاثة ميكرومترات.

يمكن حساب حجم شريحة النوريت كدالة لعرض العصب. وهنا مخاريط النمو التمثيلية وغرفة مركزية بارتفاع ثلاثة ميكرومترات. تظهر بنيتها التحتية بوضوح من ضوضاء خلفية بصرية تبلغ حوالي 20 نانومتر.

تعمل ملاحظات الفاصل الزمني للحياة على الخلايا العصبية المزروعة في غرفة بارتفاع 12 ميكرومتر لمتابعة دورة تقلص وإعادة تنشيط مخروط النمو في غضون بضع عشرات من الدقائق. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن يكون لديك إمكانية الوصول إلى معدات حفر الأيونات العميقة لتصنيع طين السيليكون. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية محاذاة غطاء زجاجي منظم مع شريحة PDMS.

بمجرد إتقانها ، يمكن تطبيق هذه التقنية بشكل متكرر على القياس الكمي لعلم الأعصاب في 3D. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأدوية لاستكشاف تأثير الأدوية المختلفة ذات العيار الفعلي في شكل مخروطي مغلق. لا تنس أن العمل مع الخلايا العصبية الأولية يتطلب الكثير من العناية لتجنب التلوث والتحطيم.

كن دائما لطيفا وسريعا عند تغيير الوسائط من أجل الحد من الوقت الذي يقضونه خارج الحاضنة.