إعادة تكوين بروتينات الغشاء

إعادة التكوين هي عملية استعادة جزيء حيوي معزول إلى شكله أو وظيفته الأصلية. غالبا ما يستخدم هذا النهج عند دراسة بروتينات الغشاء ، والتي تمكن العديد من العمليات الخلوية المهمة وتؤثر على سلوك الدهون المجاورة. ومع ذلك ، فإن تعقيد بيئة الخلية يجعل من الصعب دراسة وظائف البروتين الغشائي في الموقع.يمكن استخراج البروتينات وتنقيتها، ولكن لا يمكن تقييم وظائفها الفعلية بدون غشاء. لذلك ، يتم إعادة تكوين بروتينات الغشاء المعزولة عن طريق الاندماج في غشاء دهني اصطناعي ، مثل الجسيم الشحمي. سيقدم هذا الفيديو مبادئ إعادة تكوين البروتين الغشائي ، وإجراء إعادة التكوين العام ، وبعض التطبيقات في الكيمياء الحيوية.

تتكون أغشية الخلايا بشكل أساسي من الدهون الفوسفورية وبروتينات الغشاء. تشكل الدهون الفوسفورية طبقة ثنائية تتفاعل فيها رؤوس الفوسفات المحبة للماء مع الداخل والخارج المائي للخلية ، بينما تتفاعل ذيول الأحماض الدهنية الكارهة للماء مع بعضها البعض في الطبقة الثنائية.

تتفاعل بعض بروتينات الغشاء فقط مع الغشاء عن طريق التفاعلات الكهروستاتيكية أو غير التساهمية. البعض الآخر ، الذي يطلق عليه "البروتينات المتكاملة" ، مضمن في طبقة الدهون الثنائية.

مثل الطبقة الثنائية ، فإن البروتينات المتكاملة لها نهايات محبة للماء ومركز كاره للماء ، ويتم تثبيتها في مكانها عن طريق التفاعلات الكارهة للماء. تعرف البروتينات المتكاملة التي تمتد على الغشاء بأكمله باسم "بروتينات الغشاء".

التفاعلات بين هذه البروتينات والغشاء قوية جدا لدرجة أنه حتى تحلل الخلايا لن يفصلها. يتم استخدام مادة خافضة للتوتر السطحي خاصة تسمى المنظفات لاستخراج البروتينات. على غرار الدهون الفوسفورية ، تحتوي المنظفات على رؤوس محبة للماء وذيول محبة للدهون ، ويمكن أن تدخل الغشاء بحرية.

داخل الغشاء ، تتفاعل ذيول المنظفات المحبة للدهون مع قلب البروتين الكارهة للماء. يحيط هذا البروتين بقشرة من رؤوس المنظفات المحبة للماء ، مما يعطل تفاعلات البروتين والدهون.

يتم

الآن فصل مركب البروتين والمنظفات بسهولة عن الغشاء. يجعل المنظف المركب قابل للذوبان في المحاليل المائية ، وجاهزا لإعادة التكوين في غشاء اصطناعي.

غالبا ما يتم إعادة تكوين البروتينات في أغشية الجسيمات الشحمية ، وهي حويصلات اصطناعية. لتحضير الجسيمات الشحمية ، يتم ترطيب الدهون المجففة وتحريكها للحث على تكوين الحويصلة. عند إضافة المنظف ، يتم دمجه في أغشية الجسيمات الشحمية.

لإعادة تكوين البروتين ، يتم الجمع بين البروتينات القابلة للذوبان والجسيمات الشحمية ، ثم تتم إزالة المنظف من المحلول عن طريق غسيل الكلى أو الامتزاز الكيميائي. تتجمع البروتينات والجسيمات الشحمية بسرعة في البروتينات ، لذلك تتعرض المجموعات المحبة للماء فقط. ثم تعمل البروتينات كما تفعل في غشاء الخلية ، ويمكن فحصها بمعزل عن غيرها.

الآن بعد أن غطينا أساسيات إعادة تكوين البروتين ، دعنا ننتقل إلى بروتوكول لإعادة تكوين البروتينات الغشائية في الجسيمات الشحمية.

لبدء عزل بروتينات الغشاء ، يتم تحلل الخلايا. تتم إزالة الخلايا غير المكسورة بالطرد المركزي.

يتم الطرد المركزي للطافية بسرعة أعلى لتكسير الأغشية. يتم إعادة تعليق الحبيبات وإضافة منظف لاستخراج البروتينات.

تتم إزالة بقايا الخلية المتبقية عن طريق الطرد المركزي الإضافي. يتم تنقية البروتين من المادة الطافية باستخدام كروماتوغرافيا العمود ثم يتم تركيزه أو تنقيته حسب الحاجة.

لبدء تحضير الجسيمات الشحمية ، يتم تجفيف تعليق الدهون الفوسفورية في المذيبات العضوية تحت النيتروجين أو الأرجون.

يتم ترطيب الدهون الفوسفورية بمحلول الترطيب ، ويتم صوتنة الخليط لإنهاء إنشاء الجسيمات الشحمية.

يضاف المنظف لإذابة الجسيمات الشحمية ، والتي يتم دمجها بعد ذلك مع البروتينات.

ثم تتم إزالة المنظف عن طريق الامتزاز على حبات البوليسترين أو غسيل الكلى أو عمود ربط المنظفات. البروتيوليبوسومات الناتجة جاهزة للتنقية واستخدامها في التجارب اللاحقة.

الآن بعد أن أصبحت على دراية بأساسيات إجراء إعادة تكوين البروتين الغشائي ، دعنا نلقي نظرة على بعض تطبيقات إعادة تكوين البروتين في الكيمياء الحيوية.

أعيد تشكيل بروتين النقل الغشائي لاكتساب فهم أوضح لآلية النقل الخاصة به. تم التحقق من وظيفتها بعد إعادة التكوين من خلال تدفق أيونات اليوديد. بعد ذلك ، تمت دراسة نشاط النقل في وجود العديد من مثبطات ومقويات القنوات الأيونية الجزيئية الصغيرة. بهذه الطريقة ، يمكن دراسة التفاعلات المباشرة لهذه الجزيئات الصغيرة مع بروتين النقل.

تحصد البروتينات الغشائية المرتبطة بالكلوروفيل والكاروتينات في النباتات الضوء ، وتعزز فصل الشحنات ، وتخفف من الأضرار الضوئية. من خلال إعادة تكوين بروتينات حصاد الضوء هذه ، يمكن دراسة ديناميكيات الطي وتفاعلها مع الأصباغ. كان لبروتينات حصاد الضوء التي أعيد تشكيلها بهذه التقنية خصائص بصرية مشابهة جدا للبروتينات الأصلية. يمكن بعد ذلك استخدام التحليل الطيفي للانبعاث الفلوري لدراسة نقل الطاقة من الأصباغ إلى بروتينات حصاد الضوء المعاد تكوينها.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول إعادة تكوين بروتينات الغشاء. إعادة التكوين هي طريقة لنقل البروتينات المهمة إلى تقليد الخلية لمزيد من التحقيق. غطى هذا الفيديو مبادئ إعادة تكوين البروتين ، وبروتوكول إعادة التكوين ، وبعض التطبيقات في الكيمياء الحيوية. شكرا للمشاهدة!