نموذج ماوس الإكلينيكية من أوستيوساركوما لتعريف الاتصال خارج الخلية حويصلة بوساطة بين الورم والخلايا الجذعية الوسيطة

الهدف العام من هذا الإجراء التجريبي هو تطوير نموذج فأر قبل السريري لدراسة دور الاتصال بوساطة الحويصلة خارج الخلية بين الورم والخلايا الجذعية الوسيطة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على العديد من الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا السرطان ، حول كيفية تواصل الخلايا الجذعية السرطانية والورم عن طريق الحويصلات خارج الخلية ، وما إذا كان هذا يدعم تطور السرطان. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بدراسة دور تكيف الخلايا الجذعية الوسيطة بواسطة المركبات الكهربائية السرطانية ، على التقدم وتكوين ورم خبيث في الجسم الحي.

يمتد تأثير هذا الإجراء إلى علاجنا للسرطان ، لأنه يمكننا استخدام GSA للتدخل في اتصال EV وإشارات الأندروجين لمنع تطور السرطان. إلى جانب توفير رؤى حول الاتصال بوساطة EV في الساركوما العظمية ، يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضا على العديد من أنواع السرطان الأخرى. في الواقع ، يتم تجنيد نخاع العظم المشتق من الخلايا الجذعية الوسيطة بسهولة في المزيد من المواقع حيث يمكنهم التمايز إلى خلايا داعمة للسرطان.

ابدأ بزرع ثماني قوارير مساحتها 175 سنتيمترا مربعا مع 3 ملايين خلية 143B لكل منها. استزراع الخلايا باستخدام وسط مستنفد من EV لمدة 36 إلى 48 ساعة. عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 80 إلى 90٪ ، اجمع المواد الطافية من القوارير الثمانية لعزل المركبات الكهربائية.

بعد ذلك ، استخدم الطرد المركزي التفاضلي لإزالة جميع الخلايا وحطام الخلايا من المادة الطافية. يتكون هذا من أجهزة الطرد المركزي المتكررة عند أربع درجات مئوية ، مع أقصى تسارع وتباطؤ. بعد كل خطوة من خطوات الطرد المركزي ، اجمع المادة الطافية ، واترك وراءها ملليلترا واحدا من المادة الطافية في أنبوب الطرد المركزي.

الآن ، قم بتحميل مادة طافية تم تطهيرها مسبقا في أنابيب الطرد المركزي الفائق بمعدل 38.5 مل لكل أنبوب. بعد ذلك ، قم بعزل المركبات الكهربائية باستخدام جهاز طرد مركزي فائق عند 70،000 جرام لمدة ساعة واحدة ، مع استراحة بطيئة وعند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي الفائق ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، تاركة وراءها حوالي مليلتر واحد.

ثم, أعد تعليق الكريات المحتوية على EV في الحجم المتبقي. تجمع جميع المعلقات. واغسل المعلقات المجمعة باستخدام PBS.

املأ الأنبوب إلى 38.5 ملليلترا. بعد ذلك ، كرر دورة الطرد المركزي الفائق ، ولكن لا تستخدم أي انقطاع. يجب أن يتوقف الدوار عن الدوران بعد حوالي ساعة.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات ، واترك 100 إلى 200 ميكرولتر من المحلول. أخيرا ، أعد تعليق حبيبات EV ، واضبط الحجم النهائي على 200 ميكرولتر باستخدام PBS. يمكن بعد ذلك تمييز المركبات الكهربائية ب TEM ، أو تمييزها بالأصباغ لتجارب الامتصاص ، أو استخدامها لتعليم الخلايا الجذعية الوسيطة للتجارب في الجسم الحي.

من الأهمية بمكان أن تكون الخلايا الجذعية الجذعية الأولية في كثافة الخلايا المناسبة قبل التعرض للمركبات الكهربائية السرطانية. يجب أن تكون الخلية حوالي 70٪ ملتقية لتحقيق نسبة EV المثلى للخلية ، وكذلك لمنع فرط النمو خلال فترات التعليم. تستخدم هذه التجربة الفئران البالغة عارية Foxn1nu البالغة.

قبل يوم واحد من الإجراء الجراحي ، قم بتوفير الباراسيتامول عن طريق مياه الشرب. في يوم الجراحة ، قم بإعداد 143B خلية بمعدل 200،000 لكل ميكرولتر في PBS. قبل 20 دقيقة من الجراحة ، قم بتزويد بالبوبرينورفين.

قبل التخدير مباشرة ، قم بتحميل حقنة سعة 10 ميكرولتر بخلايا 143B المركزة. بعد التأكد من التخدير المناسب ووضع مرهم العين ، ضع على ظهره مع رجليه الخلفيتين باتجاه المشغل. بعد ذلك ، قم بتأمين قناع التخدير للحيوان.

بعد ذلك ، ثني الركبة اليسرى وامسح الجلد بثلاثة مقشرات متناوبة من 70٪ من الإيثانول وبوفيدون اليود ، ثم ضع 2٪ ليدوكائين كمسكن موضعي. الآن ، قم بعمل شق صغير في الجلد أسفل الركبة مباشرة لكشف الساق. ثم ، باستخدام مثقاب microtwist 0.8 millimiter ، قم بعمل ثقب في الظنبوب ، حوالي 2 ملم تحت الركبة.

تجنب الحفر من خلال كل من قشرتي الساق. استمر عن طريق حقن ميكرولتر واحد من الخلايا ببطء في الحفرة على مدى خمس ثوان تقريبا. ثم أغلق الفتحة بقطرة من غراء الأنسجة لمنع ارتجاع التعليق.

أكمل الجراحة عن طريق إغلاق الجلد بالخيوط وقطرة واحدة من غراء الأنسجة. اسمح للحيوان بالتعافي مع التدفئة ، ومعالجته بالباراسيتامول لمدة 24 ساعة. بعد يومين ، استخدم حقنة أنسولين 0.5 ملم لحقن الخلايا الجذعية الجذعية في الوريد الذيل.

يمكن تأكيد الإدارة الصحيحة أثناء حقن وريد الذيل بصريا. إذا ظهرت منطقة بيضاء ، أو إذا واجهت مقاومة ، فيرجى الحقن مرة أخرى في منطقة أعلى من موقع الحقن السابق. ثم ، مرتين في الأسبوع ، اتبع نمو الورم باستخدام التلألؤ البيولوجي.

حقن الفئران ب D-luciferin عبر حقنة الأنسولين ، وبعد 10 دقائق ، قم بقياس تدفق الفوتون المتولد من الخلايا السرطانية باستخدام نظام التصوير. عندما يصبح قطر الورم في أكبر من 15 ملم ، أو يتجاوز فقدان وزنه 15٪ ، قتل وجمع جميع الأنسجة ذات الصلة. قبل 10 دقائق من القتل الرحيم ، قم بحقن D-luciferin ، كما هو الحال قبل التصوير.

بعد القتل الرحيم ، اجمع الرئتين والكبد والطحال والكلى باستخدام مقص وملاقط معقمة. اغسل الدم من الأعضاء باستخدام PBS ، ورتبها على طبق بتري للتصوير. باستخدام نظام تصوير التلألؤ البيولوجي ، قم بتوثيق جانبي الأعضاء.

بمجرد التقاط الصور ، قم بإصلاح الأعضاء على الفور للتحليل النسيجي في المستقبل. لمعالجة مستندات الصور الفوتوغرافية ، ما عليك سوى تطبيق العتبة اليدوية ، وحساب عدد العقيدات في كل صورة. تأكد من استخدام نفس العتبة لكل صورة ، وتوثيق الأنسجة من كل اتجاه ، وخاصة الرئتين.

بعد إزالة الكلس من الساق في الفأر ، استمر في الجفاف وتضمين البارافين. بعد ذلك ، استخدم ميكروتوم لإعداد أقسام البارافين بحجم ستة ميكرون ، وجمع الأقسام على شرائح زجاجية. بمجرد أن تجف الشرائح ، قم بتخزينها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

في اليوم التالي ، قم بإجراء استرجاع مستضد بوساطة الحرارة ، باستخدام عازلة السترات. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الأنسجة بجسم مضاد مضاد ل GFP عند واحد إلى 900 ، واتبعه بقعة DAPI المضادة. أخيرا ، قم بتوثيق أقسام الأنسجة الملطخة باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

تم تأكيد نقاء المركبات الكهربائية المعزولة بواسطة المجهر الإلكتروني. احتوت المستحضرات على حويصلات يتراوح قطرها بين 40 و 100 نانومتر. لتقييم ما إذا كانت المركبات الكهربائية السرطانية تتفاعل مع الخلايا الجذعية الجذعية ، تم تصنيف المركبات الكهربائية بصبغة رابط محبة للدهون الفلورية الخضراء ، وتم احتضانها طوال الليل مع الخلايا الجذعية الجذعية الجذعية.

وهكذا تم تأكيد الاستيعاب الفعال للمركبات الكهربائية من قبل MSCs. تم تأكيد خاصية المعدلة المناعية للمركبات الكهربائية على الخلايا الجذعية الجذعية باستخدام مقايسة مناعية للسيتوكين متعددة الإرسال قائمة على B. تسببت المركبات الكهربائية الورمية في زيادة إنتاج IL-8 و IL-6 في الخلايا الجذعية الجذعية ، مقارنة بالمركبات الكهربائية التي تتحكم في الخلايا الليفية البشرية.

بعد ذلك ، في نموذج فأر تقويم العظام للساركوما العظمية ، تبين أن الفئران التي عولجت بالخلايا الجذعية الجذعية المتعلمة بالمركبات الكهربائية قد تسارعت من نمو الورم. بعد أربعة أيام من الحقن الجهازي للخلايا الجذعية الوسيطة التي تعبر عن GFP ، تم اكتشاف الخلايا التي تعبر عن GFP في نخاع العظم وفي أنسجة الورم ، مما يدل على أن MSC موجه إلى موقع الورم. سلط التصوير خارج الجسم الحي لأعضاء مختلفة الضوء على تكوين عقيدات الرئة.

في النهاية ، كان لدى الفئران التي تتلقى MSCs المتعلمة بالمركبات الكهربائية المزيد من النقائل الرئوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تثقيف الخلايا اللحمية مع المركبات الكهربائية السرطانية خارج الجسم الحي ، ودراسة تأثيرات الخلايا اللحمية المتعلمة في الجسم الحي باستخدام نماذج الفئران قبل السريرية. بمجرد إتقانه ، يمكن تنفيذ هذا الإجراء في غضون أربعة أسابيع ، بشرط توفر عدد كاف من المركبات الكهربائية للسرطان.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم التخطيط مسبقا والحصول على تنقية قابلة للتكرار للحويصلات السرطانية خارج الخلية ، بالإضافة إلى استخدام الخلايا الجذعية الوسيطة منخفضة الممر.