تحديد خصائص الخلايا السرطانية باستخدام سلك طبي لالتقاط تعميم الخلايا السرطانية: نهجاً ثلاثي الأبعاد استناداً إلى الفلورة والأسماك الحمض النووي
ديسمبر 21, 2017
نقدم نهجاً جديداً لتمييز الخلايا السرطانية. نحن جنبا إلى جنب الفلورة مع الحمض النووي فلوري-في الموقع-التهجين تقييم الخلايا التي استولت عليها سلك طبي فونكتيوناليزيد قادر على في فيفو إثراء ريادية مباشرة من دم المريض.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو الجمع بين تلطيخ التألق المناعي مع التهجين الفلوري للحمض النووي في الموقع على سلك وظيفي ثلاثي الأبعاد وتحديد إشارات النمط المناعي و FISH على الدعم باستخدام مجهر مضان تقليدي واسع المجال. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إفراز توصيف الخلايا السرطانية مثل تحديد الأهداف المتعلقة بالعلاج على خلايا سرطان الرئة ذات الخلايا غير الصغيرة. تتمثل الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول في السماح بتحديد متزامن لمعلمات النمط الظاهري مثل إيجابية EpCAM والتغيرات الخلوية مثل حالة جين ARC للكشف عن CTCs المفترضة.
على الرغم من أن هذه الطريقة مصممة بشكل فريد لتوفير ميزات CTC لسرطان الأنسولين في الموقع ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على دراسة السرطان الآخر مثل سرطان الثدي. قمنا بتطوير هذا البروتوكول أثناء التعامل مع السلك للتنميط المناعي المباشر والكشف عن CTC. للحصول على مزيد من البيانات ، قمنا بربط بروتوكول التنميط المناعي ببروتوكول تهجين الحمض النووي في الموقع.
التعامل مع السلك ليس بالأمر السهل ، ويرجع ذلك أساسا إلى أن الطرف الوظيفي هش. سيجعل العرض المرئي القراء يعيدون إنتاج الخطوات. لبدء التجربة ، أعد تعليق محتويات قارورة T75 بالكامل عند التقاء 80٪ في قارورة سعة خمسة ملليلتر باستخدام أربعة ملليلتر من الوسط الكامل.
بعد ذلك ، قم بإزالة السلك من عبوته الزجاجية. اغمس الجزء الذهبي الوظيفي من السلك في القارورة ، مما يضمن أن سدادة الأسلاك مناسبة لمقاومة الماء لقارورة خمسة ملليلتر. ختم السلك بفيلم مختبر.
ثم ، احتضان السلك في دوار أنبوبي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الدوران ، اشطف السلك ثلاث مرات في محلول PBS ذو طية واحدة باستخدام ثلاث قوارير نظيفة مختلفة وانتظر حتى يجف السلك. بعد تجفيف السلك بالهواء لمدة 10 دقائق في غطاء ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق غمس السلك في محلول الأسيتون بنسبة 100٪ في أنبوب سعة خمسة مليلتر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
تأكد من عدم وجود أثر للأسيتون على الطرف الوظيفي. جفف السلك بالهواء لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، في أنبوب سعة خمسة ملليلتر ، اغسل السلك مرتين في PBS طية واحدة.
احتضان السلك في مخزن مؤقت لتخفيف الأجسام المضادة. قم بإعداد 150 ميكرولترا من مزيج الأجسام المضادة مع تخفيف الجسم المضاد الأولي أحادي النسيلة المترافق مع المحلول الفلوري وتخفيف الأجسام المضادة المحدد في ورقة البيانات. بعد ذلك ، استخدم طرف P200 لاستخراج السلك من سدادة السلك وإدخال السلك برفق من خلال الفتحة الأكبر للطرف.
أدخل الطرف غير الوظيفي أولا واسحب السلك ببطء من خلال الفتحة الأصغر حتى يصبح الجزء الذهبي خارج الفتحة الأكبر مباشرة. أضف برفق 150 ميكرولترا من مزيج الجسم المضاد إلى الطرف. لتجنب خطر تكوين الفقاعات ، قم بتدوير السلك برفق حتى يتم غمر الطرف الوظيفي تماما.
أغلق فتحة الطرف ولف فيلم المختبر حول الفتحة. احتضان السلك عموديا طوال الليل في الظلام عند أربع درجات مئوية. في اليوم الثاني ، قم بمنع حضانة الأجسام المضادة عن طريق غسل السلك مرتين في PBS طاف واحد.
أعد إدخال السلك في سدادة السلك. قبل ثلاث ساعات من بروتوكول DNA-FISH ، اضبط فرن التهجين على 75 درجة مئوية واضبط الفرن الجاف على 37 درجة مئوية. قم بتبريد محلول SSC بمقدار 0.4 ضعفا إلى أربع درجات مئوية.
اغسل السلك ثلاث مرات في محلول SSC المثلج 0.4 ضعف. جفف السلك في الظلام تحت خزانة غطاء الدخان لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق ، قم بتدوير المسبار ودورانه لمدة خمس ثوان.
قم بإسقاط 10 ميكرولترات من المسبار في الأنابيب الدقيقة الزجاجية ، ثم قم بتغطيتها بغشاء معملي. لف الأنابيب الدقيقة بورق جاف ماص. ضعها في أنبوب سعة 50 مليلتر وقم بتدويرها لفترة وجيزة.
ضع السلك المجفف بعناية في الأنبوب الدقيق وأدخل سدادة السلك. ثم ، أغلق سدادة السلك بالأسمنت المطاطي. ضع السلك في غرفة رطبة مظلمة في فرن التهجين لمدة ثماني دقائق عند 75 درجة مئوية للحصول على تمسخ الحمض النووي بالكامل.
بعد ثماني دقائق ، انقل الحجرة الرطبة إلى فرن حراري جاف على حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل. ضع برطمان التلوين المنزلق بمحلول SSC 0.4 ضعفا في حمام مائي على درجة حرارة 72 درجة مئوية. تحقق من درجة حرارة محلول SSC بمقدار 0.4 ضعفا حتى تصل إلى 72 درجة مئوية أو ناقص درجة مئوية.
بعد ذلك ، قم بإعداد اثنين من الكأس الزجاجية. واحد مع محلول SSC ثنائي الطي بالإضافة إلى 0.05٪ Tween والثاني بالماء المقطر. قم بإزالة الحجرة الرطبة للفرن الجاف.
استخدم الملقط لإزالة الأسمنت المطاطي بعناية من سدادة السلك ، واسحب الطرف غير المطلي للسلك من خلال السدادة الطرفية ، مع الحرص على عدم إتلاف الطرف الوظيفي. اغمس السلك في محلول SSC 0.4 ضعاف لمدة دقيقتين عند 72 درجة مئوية. اغسل السلك في محلول SSC مزدوج بالإضافة إلى 0.05٪ Tween لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
ثم اغسل السلك بالماء المقطر في درجة حرارة الغرفة. جفف السلك تحت غطاء الدخان لمدة 10 دقائق في الظلام. احتضان الطرف الوظيفي للسلك بمحلول DAPI المعد مسبقا في قارورة ملليلتر.
اشطف السلك مرتين في PBS ذو طية واحدة وجفف السلك بالهواء. ضع السلك في حامل السلك وأدخل الطرف الوظيفي بعناية من خلال نقطة دخول الحامل الخاص حتى يتطابق الطرف مع نقطة التوصيل. ضع الحامل الخاص على مرحلة المجهر.
اضبط تركيز المجهر باستخدام عدسة 20 ضعفا. أولا ، ركز بشكل خشن على الدعم الخاص ثم اضبط بدقة على الخلايا التي تبدو ساطعة في قناة DAPI. قم فقط بتركيز الخلايا المركزية للعدسة والحصول على الصور باستخدام كاميرا رقمية 12 بت في أهداف 20x و 40x مع مرشحات مناسبة للمجسات الحمراء والخضراء والزرقاء.
أخيرا ، قم بإعداد السلك للتخزين طويل الأجل عن طريق تعبئة السلك بجوار الطرف الوظيفي وإدخال السلك بعناية في أنبوب زجاجي. قم بتخزين السلك رأسيا أو أفقيا عند سالب 20 درجة مئوية. لم يتداخل تلطيخ التألق المناعي مع إشارات DNA-FISH.
عندما تم إجراء اختبار DNA-FISH المناعي على السلك الوظيفي لدعم 3D ، كان تلطيخ EpCam مرئيا بوضوح. كشف مسبار ALK عن حذف الجينات. أظهر خط الخلايا NCI-H3122 حالة جين LAK شاذة على عكس NCI-H1975 مع النوع البري ALKG.
بمجرد إتقانه ، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول في تسع ساعات عمل إجمالية على مدار ثلاثة أيام. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم عدم لمس الجزء الوظيفي من السلك لمنع أي ضرر. يمكن استخدام الأجسام المضادة المختلفة ومجسات FISH باتباع هذا البروتوكول للإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد الخلايا بعلامات النمط الظاهري الأخرى والتغيرات الوراثية الخلوية الأخرى مثل تضخيم جين NAT أو HAR2.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد CTCs المفترضة في وقت واحد من خلال معلمات النمط الظاهري مثل إيجابية EpCAM واكتشاف التغيرات الوراثية الخلوية مثل حالة جين ARC. لا تنس أن العمل مع الأسيتون والفرن يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل التعامل مع الأسيتون في غطاء المحرك وارتداء القفازات الواقية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة جديدة لتمييز الخلايا السرطانية من خلال دمج التألق المناعي مع تهجين الحمض النووي الفلوري في الموقع (FISH). يعتمد هذا النهج على استخدام سلك طبي مُعدّل لإثراء الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) مباشرة من دم المريض، مما يسهل تحديد المؤشرات المناعية والوراثية الرئيسية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأورام
- بيولوجيا الخلية
- طرق التشخيص
الخلفية
- إن تمييز الخلايا السرطانية المتداولة أمر بالغ الأهمية لتشخيص وعلاج السرطان.
- غالبًا ما تفتقر الطرق الحالية إلى القدرة على تقييم معايير متعددة في وقت واحد.
- تهدف هذه الدراسة إلى تحسين اكتشاف وتحليل الخلايا السرطانية المتداولة في سرطان الرئة غير صغير الخلايا.
- يمكن أيضًا تكييف البروتوكول لأنواع أخرى من السرطان، مثل سرطان الثدي.
هدف الدراسة
- تطوير بروتوكول يجمع بين التألق المناعي وFISH-DNA لتمييز الخلايا السرطانية المتداولة.
- تحديد الأهداف المتعلقة بالعلاج على الخلايا السرطانية المتداولة.
- تعزيز فهم بيولوجيا الخلايا السرطانية من خلال التحليل المتزامن للخصائص النمطية والوراثية.
الطرق المستخدمة
- سلك مُعدّل لالتقاط الخلايا السرطانية المتداولة من عينات الدم.
- تلطيخ التألق المناعي لتقييم النمط المناعي.
- FISH-DNA لتحليل التغيرات الوراثية.
- المجهر لتصوير وجمع البيانات.
النتائج الرئيسية
- التعرف بنجاح على الخلايا السرطانية المتداولة ذات المؤشرات المناعية النمطية المحددة.
- اكتشاف التغيرات الوراثية المرتبطة بخصائص الورم.
- أظهرت جدوى الطريقة لأنواع مختلفة من السرطان.
- يسمح البروتوكول بالتكرار وسهولة الاستخدام في البيئات المخبرية.
الاستنتاجات
- إن طريقة التألق المناعي وFISH-DNA المدمجة فعالة لتمييز الخلايا السرطانية المتداولة.
- يمكن أن يوفر هذا النهج رؤى حول بيولوجيا الورم وأهداف العلاج.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى أنواع أخرى من الأورام الخبيثة إلى ما وراء سرطان الرئة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method addresses the critical challenge of rare circulating tumor cell (CTC) detection by enabling high-volume blood sampling and simultaneous phenotypic and genetic analysis. By integrating immunofluorescence and DNA FISH on a 3D functionalized wire, it provides a scalable approach for CTC enrichment and characterization directly from peripheral blood. The workflow supports early discovery efforts by delivering multiplexed data on cell surface markers and chromosomal alterations, informing target validation and patient stratification strategies in oncology drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic targets through simultaneous detection of EpCAM positivity and ALK gene translocation in captured CTCs.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking by correlating phenotypic markers with cytogenetic alterations in a single workflow.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing multiplexed data on putative CTCs for hypothesis-driven target validation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by capturing CTCs from large blood volumes (1.5–3 L) via 30-minute wire incubation.
- Reproducibility: Standardizes CTC isolation and immuno-DNA FISH processing on a 3D support, enabling consistent phenotypic and genetic readouts.
- Quantitative Output: Generates measurable immunofluorescence and FISH signals detectable via conventional widefield fluorescence microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrated feasibility in NSCLC cell lines (NCI-H3122 and NCI-H1975) for EpCAM and ALK status, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking CTC phenotype to genotype in disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in CTC characterization by co-localizing protein expression and gene status on individual cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, offering a reusable capability for CTC analysis across oncology indications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling simultaneous phenotypic and genetic profiling of rare CTC populations.
- Screening: Delivers assay-ready CTC samples with standardized isolation and staining protocols for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative readouts (EpCAM intensity, ALK FISH signals) that allow comparative analysis across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation through disease-relevant CTC characterization in NSCLC models.
- Enterprise Reuse: Functions as a platform technology adaptable to multiple cancer types (e.g., breast cancer) and diverse antibody/FISH probe combinations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in CTC biomarker studies by reducing mechanistic ambiguity through correlated phenotyping and genotyping.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability via a wire-based system compatible with conventional microscopy and standard reagents.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering multiparametric CTC data that inform target specificity and patient selection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on CTC phenotype-genotype concordance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, DNA FISH, and delicate handling of functionalized wire tips to prevent damage.
- Depends on access to a conventional widefield fluorescence microscope with appropriate filter sets for DAPI, FITC, and Cy3/Cy5 equivalents.
- Necessitates cross-team standardization of wire preparation, incubation, and imaging protocols to ensure reproducibility across sites.
- Involves adaptation considerations when extending the protocol to different cancer types or alternative phenotypic/genetic markers.
- Includes practical limitations such as the fragility of the wire’s functionalized tip and the need for hazardous material precautions (acetone, ovens).
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:34
Immuno-DNA FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) on Wire
2:35
Fixation, Permeabilization, and Immunofluorescence
4:25
3D DNA FISH Day 2
6:08
3D DNA FISH Day 3
7:51
3D Microscope Observation and Analysis
9:01
Results: No Interference Bewteen Immunofluorescence and DNA FISH Signals
9:38
Conclusion
