مقايسة تحول الحركة الكهربية (EMSA)

EMSA ، مقايسة تحول الحركة الكهربية ، والمعروفة أيضا باسم مقايسة تحول الهلام ، هي إجراء كيميائي حيوي متعدد الاستخدامات وحساس. يوضح EMSA الارتباط بين البروتينات والأحماض النووية عن طريق اكتشاف التحول في النطاقات في الرحلان الكهربائي للهلام.

يصف هذا الفيديو مبادئ EMSA ، ويقدم إجراء عاما ، ويناقش بعض التطبيقات.

يعد تكرار الحمض النووي ونسخه وإصلاحه ، بالإضافة إلى معالجة الحمض النووي الريبي ، كلها عمليات كيميائية حيوية مهمة. تنطوي جميعها على ارتباط بين البروتينات والأحماض النووية. ترتبط العديد من الأمراض والاضطرابات الخطيرة بتعديلات في هذا الربط. EMSA هي تقنية لتحديد نوعي ما إذا كان بروتين معين يرتبط بحمض نووي معين. أولا ، يتم تمييز الحمض النووي ، عادة بالفوسفور المشع -32 ، لإنشاء مسبار. ثم يتم خلط بروتين الاختبار ومسبار الحمض النووي. عندما يرتبط البروتين بمسبار الحمض النووي ، فإن المركب الناتج له كتلة أكبر وتشكل مختلف عن الحمض النووي وحده.

بمجرد ربطها ، يتم تحليل المجمعات باستخدام الرحلان الكهربائي للجل. في هذه التقنية ، يجبر المجال الكهربائي الجزيئات الكبيرة على الهجرة عبر مصفوفة هلامية. تنفصل المكونات بناء على الكتلة والشحنة والتشكل. يمكن أن يفصل الرحلان الكهربائي مجمعات البروتين والحمض النووي عن المجسات غير المرتبطة. نظرا لأن لديهم كتل ومطابقات مختلفة ، فسوف يهاجرون عبر الجل بمعدلات مختلفة وينفصلون. يتم اكتشاف الفصل بسهولة ، وذلك بفضل وجود الفوسفور المشع ، ويثبت أن البروتين يرتبط بنجاح بالحمض النووي المحدد. للتحقق من تحديد البروتين ، يستخدم “اختبار التحول الفائق” جسما مضادا له صلة معروفة بالبروتين. هذا له فائدة إضافية تتمثل في زيادة التحول في المعقدة وزيادة الدقة.

الآن بعد أن رأينا المبادئ ، دعنا نراها في المختبر.

لبدء الإجراء ، يجب عزل البروتين. للقيام بذلك ، يتم استخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية للتعبير عن البروتين في الخلايا ، ثم تنقيتها.

يتم تضخيم الحمض النووي وتصنيفه لإنشاء مسبار. يتم وضع العلامات من خلال الحضانة لمدة 10 دقائق باستخدام dCTP الذي يحتوي على الفوسفور المشع -32. مطلوب منضدة عمل آمنة للإشعاع ومعدات واقية.

ثم يتم تحضير الجل. يجب أن يكون الجل غير متحول إلى الطبيعة ، لمنع البروتين من تغيير التشكل وربما فك الارتباط بالمسبار أثناء الرحلان الكهربائي. تحتوي المواد الهلامية بولي أكريلاميد على أحجام مسام تتراوح من 5 إلى 20 نانومتر وهي مفيدة للمجسات القصيرة التي يصل طولها إلى 100 زوج أساسي. تحتوي المواد الهلامية Agarose على أحجام مسام تتراوح من 70 إلى 700 نانومتر وهي مفيدة للمجسات الأكبر.

مع إعداد مسبار البروتين والحمض النووي الآن ، ننتقل إلى الربط. يتم تحضير محلول عازلة TRIS وإضافة البروتين والمسبار. يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني مشابها للظروف الفسيولوجية ، وأن يكون تركيز الملح كافيا لمنع البروتين من تكوين روابط ضعيفة مع الأحماض النووية غير المستهدفة. يستمر التفاعل لمدة 20-30 دقيقة عند 4 درجات مئوية

الخطوة التالية هي الرحلان الكهربائي. يتم استخدام مخزن مؤقت ذو قوة أيونية منخفضة ودرجة حموضة مماثلة لتلك المستخدمة في تفاعل الربط. ينتج عنه “تأثير قفص” يعمل على استقرار المجمعات وزيادة الحركة وتقليل توليد الحرارة. بعد الرحلان الكهربائي ، يتم نقل مكونات الجل إلى ورق الترشيح. في غرفة مظلمة ، يتعرض ورق الترشيح بعد ذلك للفيلم. إذا ارتبط البروتين بالمسبار ، فستكون هناك منطقتان متميزتان مسمويتان مرئيتان في النقل. أحدهما يمثل المركب ، والآخر منفصل يمثل المسبار غير المرتبط. يوضح الفصل أن البروتين مرتبط بنجاح بالحمض النووي.

الآن بعد أن رأينا الإجراء الأساسي ، دعنا نلقي نظرة على بعض التطبيقات.

الكروماتين هو مركب معبأ بإحكام من الحمض النووي والبروتينات الموجودة في الخلايا حقيقية النواة. تقوم إنزيمات إعادة تشكيل الكروماتين بتعديل الهيكل لفتح الحمض النووي للنسخ. نظرا لأن هذا يغير حركة المجمع ، يمكن استخدام EMSA لاستكشاف نشاط ربط الإنزيم.

يستفيد النهج البديل لوضع العلامات من التفاعل بين الحمض النووي وإنزيم ميثيل ترانسفيراز. يمكن تعديل العامل المساعد للارتباط بشكل دائم بالحمض النووي عبر ميثيل ترانسفيراز. بدلا من وضع العلامات بالفوسفور 32 ، يتم اقتران العامل المساعد مع البيوتين ، وهو أمر مفيد لأنه ليس مشعا.؟ نظرا لأن العامل المساعد خاص بالموقع في ارتباطه ، فهو وثيق الصلة بالتنميط الجيني واكتشاف المثيلة وتوصيل الجينات. يتم الكشف عن الأحماض النووية البيوتينية من خلال الأشعة فوق البنفسجية.

عندما تنشط المحفزات البيئية كينازات الهيستيدين ، فإن منظم الاستجابة؟ هو فسفرة. وهذا بدوره يرتبط بالحمض النووي ، مما يؤثر على النسخ ، والذي يمكن دراسته بواسطة EMSA. على سبيل المثال ، منظم الاستجابة في؟ تم إثبات ارتباط Desulfovibrio vulgaris بالجين محل الاهتمام. تم استخدام EMSA للتحقق من حدوث الربط.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول مقايسة تحول الحركة الكهربائية. يجب أن تفهم الآن مبادئ تشغيلها والخطوات في إجراءاتها ومعايير التشغيل الرئيسية الخاصة بها.

شكرا للمشاهدة!