تصور "ديناميات ليجنيفيكيشن" في النباتات مع "انقر فوق الكيمياء": "وسم المزدوج" هو النعيم!

الهدف العام من منهجية وضع العلامات المزدوجة هذه هو مراقبة مناطق التقشير النشطة للأنسجة النباتية. في سير العمل هذا ، يتم تطبيق استراتيجية المراسل الكيميائي باستخدام اثنين من المراسلين الكيميائيين المتميزين في مجموعة متسلسلة من تفاعلات كيمياء النقر المتعامدة الحيوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فك تشفير الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا النبات مثل تحديد العوامل التي تنظم التكوين المكاني أو الزمني للجنين داخل النباتات والجدران.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستهدف حصريا اللجنين الذي يتم إنتاجه أثناء الدمج الأيضي. يميزه عن أي لجنين موجود مسبقا في العينة. على الرغم من أننا طورنا هذه الطريقة في الأصل لدراسة أعلام التقشير ، إلا أنه يمكن استخدامها مع أنواع أخرى مثل الأرابيدوبسيس أو الحور أو في الواقع أي نبات آخر ينتج اللجنين.

لتقديم هذه التقنية ، لدينا كليمنس سيمون ، وهو طالب دكتوراه يعمل في الواجهة بين الكيمياء وعلم الأحياء ، والذي يستخدم هذه التقنية لدراسة ديناميكيات التقشير. أولا ، قم بإعداد محلول مراسل كيميائي سعة 300 ميكرولتر يحتوي على عشرة ميكرومولر من مراسل G الموسوم بالألكين. وعشرة ميكرومولر من مراسل H الموسوم بالأزيد ووسط معقم سائل 1/2 مللي ثانية.

قم بتدوير المحلول ونقله إلى بئر واحد من صفيحة 48 بئرا باستخدام ماصة نقل. قم بإعداد محلول تحكم سلبي سعة 300 ميكرولتر يحتوي على عشرة ميكرومولر من G وعشرة ميكرومولر من H ووسط سائل معقم 1/2 مللي ثانية. دوامة المحلول وانقله إلى بئر ثان من نفس اللوحة المكونة من 48 بئرا.

باستخدام شفرة حلاقة نظيفة ، قم بقطع جذع نبات الكتان البالغ من العمر شهرين على ارتفاع عشرة سنتيمترات فوق مستوى التربة. قم بإعداد 50 مقطعا عرضيا لليد الحرة من الساق باستخدام شفرة الحلاقة ووضعها على الفور في وسط 1/2 مللي ثانية. بعد ذلك ، حدد المقاطع العرضية الكاملة السليمة ووزع عشرة منها بشكل عشوائي في البئر المملوء بمحلول المراسل الكيميائي ، مع الحرص على عدم إتلاف الأنسجة.

يجب قطع المقاطع العرضية بإحكام ونظيفة ويجب أن يكون المقطع العرضي مستقيما. أنت بحاجة إلى يد ثابتة وشفرة حلاقة حادة للحفاظ على الأنسجة سليمة. ينصح بالتدرب مسبقا.

بعد توزيع عشرة مقاطع عرضية سليمة في محلول التحكم السلبي ، قم باحتضان اللوحة في ضوء مستمر في غرفة نمو عند 20 درجة مئوية لمدة 20 ساعة. في اليوم التالي ، قم بإزالة المحلول أحادي الوجنة في كل بئر باستخدام ماصة دقيقة. أضف 500 ميكرولتر من 1/2 مللي ثانية متوسطة إلى كل بئر وحركه برفق لمدة عشر دقائق.

ثم قم بإزالة محلول الشطف باستخدام ماصة دقيقة. قم بإعداد مليلتر واحد من محلول الإضافة الحلقية للأزيد الألكين المعزز بالسلالة. تحتوي على خمسة ميكرومولر من صبغة الفلورسنت ذات العلامات السيكلوكتين ووسط سائل معقم 1/2 MS.

ثم ، دوامة الحل. بعد خطوات الغسيل النهائية لبروتوكول دمج التمثيل الغذائي ، قم بإزالة وسط 1/2 مللي ثانية وأضف 300 ميكرولتر من محلول SPAAC إلى كل بئر باستخدام ماصة دقيقة. احم اللوحة المكونة من 48 بئرا من الضوء بوضعها في صندوق.

ثم حرك اللوحة برفق على شاكر ميكانيكي لمدة ساعة في الظلام في درجة الحرارة المحيطة. بعد ذلك ، اغسل كل بئر أربع مرات بوسط 1/2 مللي ثانية كما هو موضح سابقا ، مع إبقاء الطبق في الظلام. قم بإعداد مليلتر واحد من محلول الإضافة الحلقية المحفز للأزيد المحفز بالنحاس الذي يحتوي على أسكوربات الصوديوم وكبريتات النحاس وصبغة الفلورسنت الموسومة بالأزيد ووسط السائل المعقم 1/2 مللي ثانية.

ثم دوامة الحل. بعد إزالة وسط 1/2 مللي ثانية ، ضع اللوحة في صندوق وأضف 300 ميكرولتر من محلول CuAAC إلى كل بئر باستخدام ماصة دقيقة. حرك اللوحة برفق على شاكر ميكانيكي لمدة ساعة واحدة في الظلام في درجة الحرارة المحيطة.

قم بإزالة اللوحة من شاكر الميكانيكية وقم بإزالة محلول CuAAC من كل بئر باستخدام ماصة دقيقة. ثم أضف 500 ميكرولتر من متوسط 1/2 مللي ثانية وحرك اللوحة على شاكر ميكانيكي لمدة عشر دقائق في الظلام. بعد الغسيل مرتين أخريين بوسط 1/2 مللي ثانية ، أضف 500 ميكرولتر من محلول الميثانول والماء 7: 3 إلى كل بئر.

حرك اللوحة على شاكر ميكانيكي لمدة ساعة في الظلام. ثم قم بإزالة المحلول من الآبار. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من 1/2 مللي ثانية متوسطة إلى كل بئر وحركه في الظلام لمدة عشر دقائق.

بعد تكرار هذا الغسيل أربع مرات ، احتفظ بالمقاطع العرضية المخزنة في وسط 1/2 مللي ثانية ، محمية من الضوء. ضع خمس قطرات من وسط التركيب على شريحة مجهر زجاجي. بعد ذلك ، قم بإيداع كل مقطع عرضي يحمل علامة المراسل الكيميائي بعناية على الشريحة.

ضعي طلاء الأظافر على جانبي الشريحة. قم بتغطية الشريحة بزلة غطاء ، مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء. ثم قم بإزالة وسط التثبيت الزائد باستخدام منشفة ورقية.

بعد ذلك ، قم بإغلاق العينة بطلاء الأظافر من جميع الجوانب الأربعة. بعد أن يجف طلاء الأظافر ، قم بتخزين الشرائح عند أربع درجات مئوية في الظلام حتى المراقبة تحت المجهر متحد البؤر. تميل أقسام النبات إلى أن تصبح هشة عندما تجف.

تأكد من الاحتفاظ بها دائما في المحلول وإغلاق زلات الغطاء بطلاء الأظافر من جميع الجوانب. يزيد من العمر الافتراضي للشرائح المركبة. ضع شريحة العينة على مرحلة المجهر تحت العدسة الشيئية.

راقب العينة وتدويرها لتحديد المنطقة المرغوبة من الأنسجة النباتية. بعد ذلك ، حدد المستوى الأكثر فلورية في المحور Z. اضبط الكسب والإزاحة وطاقة الليزر لتحقيق التوزيع الأمثل للإشارة على طول نطاق المستوى الرمادي بالكامل لكل قناة.

أخيرا ، احصل على صور متحدة البؤر عالية الجودة. يوفر BLISS ثلاث خرائط توطين لونية للجنين داخل جدران الخلايا النباتية ، ويستهدف حصريا اللجنين المنتج من جديد أثناء دمج التمثيل الغذائي ويميزه عن اللجنين الموجود مسبقا في العينة. يسلط الضوء على مواقع التقشير النشطة داخل الأنسجة المختلفة للعضو داخل أنواع مختلفة من الخلايا من الأنسجة ، أو داخل طبقات الجدار المختلفة أو الهياكل الأساسية للخلية.

تشير ملفات تعريف دمج مراسل G وعلامة الأزيد من الكامبيوم إلى اللب داخل نسيج الخشب الثانوي للكتان إلى أنه يتم الوصول إلى أقصى قدر من التقشير بسرعة في القصبات الهوائية الليفية أثناء التطور ، بينما تستمر خلايا العرق في دمج اللجنين في مراحل لاحقة من حياتها. يوضح تغيير نسبة المراسل الكيميائي أن تكوين اللجنين في أنسجة نسيج الخشب الثانوية يعتمد بشكل مباشر على توافر أحادي القشرة داخل جدران الخلايا. بدلا من خصوصية البيروكسيديز أو اللاكاز أثناء بلمرة اللجنين.

يقتصر دمج المراسل الكيميائي على زوايا الخلية وجدار الخلية الأولية الصفيحة الوسطى لبعض ألياف اللحاء ، ولكن ليس كلها. في جذور الكتان ، يتم دمج المراسلين الكيميائيين في جدران خلايا الأديم الباطن حيث يكون الشريط الكاسباري غائبا. للحصول على تصور أفضل لبنية الأنسجة ، يمكن أيضا إنشاء عمليات إعادة بناء مكدس 3D Z.

بعد هذه المعالجة المرئية ، يمكن أيضا إجراء معالجة شاملة للبيانات. جميع الاحتياطات المتخذة ، من الممكن الحصول على نتائج ثابتة عن طريق المقارنة النسبية ، وقراءة عينة بين عينات مختلفة. يمكن القيام بذلك بالإضافة إلى توطين القيادة النشطة في مناطق مختلفة.

هذه الطريقة هي أداة رائعة لعلماء الأحياء النباتية مثلي الذين يدرسون جدار الخلية. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بذلك في غضون ساعات قليلة. إنه حساس للغاية ويمكن تطبيقه على مجموعة كاملة من أنظمة النماذج التجريبية المختلفة في المختبر في الجسم الحي.

إن تطبيق استراتيجية المراسل الكيميائي على اللجنين يمهد الطريق لعالم الأحياء الكيميائية لاستكشاف ديناميكيات التقشير ومعرفة ما الذي يتحكم في عملية البلمرة هذه ، والتي لا تزال تشكل في كثير من النواحي منطقة مجهولة.