تصور المتداول الكريات البيض والالتصاق في الفئران التي غرست الثاني انجيوتنسين: تقنيات والمزالق

الهدف العام من هذا الفحص المجهري داخل الحيوية ، أو بروتوكول IVM للأوعية الدموية هو تصور وقياس تدحرج الكريات البيض والالتصاق في الشرايين المتآكلة في ارتفاع ضغط الدم الناجم عن الأنجيوتنسين الثاني في الفئران. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أمراض الخلل الوظيفي الوعائي وارتفاع ضغط الدم الشرياني مثل آلية التفاعل بين الكريات البيض وخاصة الجسيمات الحالة والخلايا الإيجابية ، وعمل الأوعية الدموية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا رؤية التفاعلات في الجسم الحي بين خلايا الدم المنتشرة وفهم الأوعية الدموية.

تحضير فأر ذكر للجراحة بعد سبعة أيام من الأنجيوتنسين اثنين العلاج بمضخة تناضحية وفقا للنص بروتول. ضع مرهم العين على العينين لحمايتهما أثناء العملية. ضع المخدر في الاستلقاء الظهري على صفيحة جراحية بدرجة حرارة 39 درجة مئوية وأدخل مسبارا مستقيميا للحفاظ على درجة الحرارة.

استخدمي قطعة قطن لدهن كريم إزالة الشعر وفركه في الرقبة حتى يبدأ الشعر في التساقط. ثم ، بعد دقيقتين إضافيتين ، استخدمي ملعقة لإزالة الشعر والقشدة. ثم قم بتطهير الجلد باستخدام مطهر كحولي للبشرة.

بعد ذلك ، تحت المجهر المجسم ، قم بعمل شق طولي من 1 إلى 1.5 سم في جلد الرقبة ، على بعد 1 سم من القصبة الهوائية. ثم قم بعمل شقين عموديين على طرفي الشق الأول. قم بإزالة الأنسجة الموجودة تحت الجلد بعناية وإزالة قطعة الجلد التي تغطي الوريد الوداجي الأيسر والقصبة الهوائية.

بعد ذلك ، استخدم ملقطين منحنيين لعزل الغدد المتآكلة تحت اللسان وتحت الفك العلوي بعناية من منطقة الاهتمام. مع الحرص على عدم قطع الغدد أو إتلافها ، ضعها للسماح بأفضل وصول إلى الوريد الوداجي والكوريديس. بعد ذلك ، لعزل الوريد الوداجي ، أدخل ملقطا رفيعا بين الوعاء والأنسجة المحيطة ، وافتح الجهاز وأغلقه ببطء لتحرير الوريد برفق من الأنسجة.

بمجرد أن يصبح الوريد الوداجي نظيفا تماما ، ضع الملقط أسفل الوعاء وضع خيوط بطول 10 سم 7-0 تحته. اربط عقدتين لإغلاق الخيط القريب من الرأس ومع الخيط الثاني ، قم بإعداد عقدة واحدة ، لكن لا تغلقها. الآن ، باستخدام ملقط في يد واحدة ، أمسك القسطرة المملوءة بمحلول ملحي معقم 37 درجة مئوية ، ثم باستخدام اليد الأخرى ، استخدم مقصا أو إبرة منحنية قياس 26 لعمل شق صغير في الوعاء.

أدخل القسطرة في الوريد الوداجي ، وأغلق العقدة مرتين. بعد ذلك ، أغلق الخيط القريب من الرأس فوق القسطرة لضمان الشلل الكامل. لعزل الشرايين المتآكلة وتحضيرها ، استخدم ملقطا منحنيا رفيعا لتشريح المنطقة التي تغطي القصبة الهوائية.

بعد ذلك ، بمجرد أن تصبح التآكل خالية من الأنسجة المحيطة ، قم بإزالة عصب فيغاس من الوعاء دون قطعه ، عن طريق إغلاق الملقط الرفيع وفتحه ببطء ، إذا لزم الأمر ، لتحريك العصب برفق. بمجرد أن يصبح كلا الشرايين نظيفين تماما ، ضع الملقط تحت الشريان الأول المتآكل ، ومع الحرص على عدم إفراط في شد الوعاء الدموي ، ضع حامل وعاء بلاستيكي أسود صغير مقاس 3 مم × 2.5 سم أسفل الوعاء. بمجرد وضع حامل الوعاء في مكانه ، تأكد من وجود تدفق الدم.

لتجنب شد الوعاء ، يجب أن تتحرك يد المشغل بأقل قدر ممكن بحركة واحدة من الملقط الأول لعزل الشريان المتآكل ومساعدة الملقط الثاني لإحداث ثقب أسفل الوعاء. عندما يتم وضع حامل الوعاء بشكل صحيح ، ضع الشريان الثاني فوق الجهاز. إذا لم يتم وضع الفأر مباشرة تحت المجهر ، ضع الغدد مرة أخرى فوق القصبة الهوائية ، وقم بتطبيق محلول ملحي معقم بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لتجنب جفاف المنطقة.

في حقنة سعة 1 مل ، قم بإعداد مخفف 1-4 في محلول ملحي معقم ، من محلول مرق مذاب 2 مجم لكل مل من البرتقال الأكريدين. حماية المحقنة من الضوء. لإجراء القياسات ، ضع الماوس تحت مجهر الإزهار عالي السرعة وواسع المجال باستخدام مكثف لمسافات طويلة وهدف غمر الماء 10x مع أحادي اللون وفاصل شعاع وكاميرا CCD.

احصل على الصور في الوقت الفعلي من خلال تركيز الهدف في منتصف الشريان المتآكل على السطح البطاني. حقن ببطء 50 مل من برتقال أكريدين. بعد ذلك ، اضبط البرنامج لتسجيل 100 صورة ، مع وقت تعرض يبلغ 120 مللي ثانية لكل صورة.

سجل أربعة مقاطع فيديو لكل شريان متآكل في مواقع مختلفة على الشريان لكل مقطع فيديو. إذا انخفضت إشارة الفلورسنت ، فقم بحقن 50 مل أخرى من برتقالي أكريدين. لاختبار ظروف مختلفة ، قم بحقن برتقالة الأكريدين مباشرة في وريد الذيل الجانبي إذا لم يتم إدخال قسطرة وداجي ، وقم بإجراء نفس الحصول على الصورة.

كعنصر تحكم ، قم بتسجيل قياسات الإزهار من الفئران غير المحقونة إيجابية lys-Mcre وإيجابية IRG. حدد كمية الخلايا المتدحرجة والالتصاق في عرض مستطيل 200 ميكرون × 250 ميكرون موضوعة في منتصف الوعاء لكل مقطع فيديو ، معروضة بسرعة 10 صور في الثانية. عد الخلايا المتدحرجة والالتصاق.

تعرف خلايا الالتصاق بأنها خلايا لا تتحرك أو تنفصل عن البطانة خلال الفيديو الذي تبلغ مدته 10 ثوان. لتبسيط القياس الكمي ، قم بإزالة القناة ذات التألق الأحمر ، واستخدم فقط التألق الأخضر لحساب الخلايا المتدحرجة والملتصقة. في هذه الدراسة ، لوحظت تآكل الفئران الإيجابية ل lys-mCre والإيجابية ل IRG الممزوجة بالأنجيوتنسين 2 باستخدام IVM.

كما هو موضح هنا في خط الأساس ، أدى وجود قسطرة وداجي إلى التصاق الخلايا الفلورية الإيجابية lys-M. بعد حقن البرتقال أكريدين ، كانت الخلايا البطانية أيضا فلورية. بعد ذلك ، كشف تقليل الخلفية للحد من التألق المرتبط بالبطانة ، أن جميع الخلايا الملتصقة ذات النواة كانت إيجابية lys-M.

في هذه التجربة ، بعد أسبوع واحد من تسريب الأنجيوتنسين 2 ، تم تصوير تفاعلات بطانة الكريات البيض في الشرايين المتآكلة للفئران الإيجابية ل lys-M Cre الإيجابية IRG ، وتصورها بواسطة IVM ، مع أو بدون حقن أكريدين برتقالي ، عبر قسطرة وداجي أو من خلال الوريد الذيل. بدون أي قسطرة أو حقن ، زاد تدحرج الخلايا الإيجابية lys-M بشكل ملحوظ بعد تسريب الأنجيوتنسين 2 ، مقارنة بالفئران غير المعالجة. كما زاد الالتصاق.

حقن برتقال أكريدين بقسطرة وداجي إلى زيادة الالتصاق والدحرجة في الفئران المعالجة بالأنجيوتنسين 2 ، إلى حد أكبر مقارنة بالفئران التي لا تحتوي على قسطرة. أخيرا ، كما هو موضح في هذه الألواح ، يؤدي حقن البرتقال الأكريدين في الوريد الذيل إلى التصاق وتدحرج مماثل مقارنة بالفئران التي لم تتلق حقن برتقال أكريدين. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ثلاثين دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم إتلاف الأنسجة المحيطة بالأوعية. بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات القلب والأوعية الدموية والمرقئ لاستكشاف الكريات البيض والتصاق الصفائح الدموية بجدار الأوعية الدموية في الجسم الحي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحد من تأثير حقن الصبغة والجراحة في IVM.

لا تنس أن العمل مع الأصباغ الفلورية المتداخلة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب تجنب ملامسة الجلد للصبغة بالمواد المناسبة ، مثل القفازات.