في فيفو تتبع في محطة Presynaptic الأعصاب الحركية المورفولوجية جزيء واحد
January 14th, 2018
هنا توضح لنا كيف جزيء واحد التعريب تنشيط صور مجهرية يمكن الاضطلاع على المحطة الطرفية الأعصاب الحركية ليعيش melanogaster المورفولوجية الثالثة instar اليرقة.
في الجسم الحي تتبع الجزيء الفردي في ذبابة الفاكهة الطرف العصبي الحركي قبل المشبكي. تصف هذه التقنية كيف يمكن تتبع البروتينات المفردة وتصويرها في الجسم الحي في الأطراف العصبية الحركية ليرقات ذبابة الفاكهة في الأطوار الثالث. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتصوير البروتينات المفردة وتتبعها وتوطينها بدقة عالية مماثلة لتلك التي لوحظت في الأنظمة المختبرية.
تصميم ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا. يتم تمييز البروتين المشبكي ذي الأهمية بفلوروفور قابل للتحويل الضوئي ، ويتم التعبير عن ذلك في ذبابة الفاكهة السوداء. تشريح يرقة ذبابة الفاكهة في الطور الثالث.
ضع يرقة متجولة من الطور الثالث على قاعدة سيلجارد أسطوانية أو شبه أسطوانية. أضف 40 ميكرولترا من وسط حشرات شنايدر إلى اليرقة. تحت مجهر تشريح ، قم بلصق دبوس صغير في الرأس وآخر من خلال ذيل اليرقة لشل حركتها.
لتوفير الوصول ، استخدم دبوسا صغيرا لعمل شق ضيق في خط الوسط للجانب الظهري من منطقة بطن اليرقة. من نقطة الشق هذه ، باستخدام مقص الزنبرك ، قم بقص جدار الجسم في الاتجاه الخلفي الأمامي. قم بإزالة الأعضاء الداخلية من اليرقة بمساعدة ملقط ناعم ومقص زنبركي.
اغسل اليرقة المقطوعة باستخدام وسط حشرات شنايدر. قم بلصق دبابيس دقيقة من خلال كل من اللوحات الجدار للجسم لإنتاج مستحضر يرقة مقطعة على شكل سداسي. استخدم المقص الزنبركي لفصل دماغ اليرقة عن الحبل العصبي البطني.
باستخدام ملاقط منحنية ، ادفع دبابيس الدقيقة إلى قاعدة Sylgard. فحص مجهري توطين تتبع الجسيم الفردي المنشط بالصورة. اقلب قاعدة سيلجارد لليرقة على طبق استزراع ذو قاع زجاجي مليء بملليلترين من وسط حشرات شنايدر بدرجة حرارة الغرفة.
ضع الماء على هدف الغمر في الماء 63x لمجهر ELYRA PS.1 ثم ضع الطبق على المسرح. قم بتشغيل الضوء المرسل واستخدم العدسة لتحديد موقع اليرقة على قاعدة سيلجارد بمساعدة الهدف الجوي 10x. قم بالتبديل إلى هدف الغمر في الماء 63x ، وحدد العضلات الستة ، باستخدام إضاءة المجال الساطعة.
باستخدام برنامج ZEN Black Acquisition ، حدد تكوين إجمالي انعكاس الانعكاس الداخلي ، TIRF. قم بتبديل الليزر 488 نانومتر لتصور eMos2 باللون الأخضر. حدد موقع التقاطعات العصبية العضلية ، التي تبدو وكأنها حبات على خيط ، واحصل على صورة TIRF منخفضة الدقة ، وقم في نفس الوقت بتشغيل الليزر 405 نانومتر والليزر 561 نانومتر لتحويل الصور وتصوير الأنواع الحمراء eMos2.
استخدم طاقة ليزر منخفضة جدا لليزر 405 نانومتر للسماح بتحويلات ضوئية عشوائية ثابتة إلى حد ما. هنا ، يتم تشغيل ليزر 405 نانومتر بنسبة 0.09٪ بينما يتم تشغيل ليزر 561 نانومتر بنسبة 50٪ في خيارات زاوية TIRF على البرنامج ، قم بتمرير الزاوية الحرجة TIRF قليلا. اضبط وقت التعريض الضوئي على 30 مللي ثانية.
الحصول على سلسلة زمنية من الصور للتقاطع العصبي العضلي. هنا ، تم الحصول على فيلم 15 ، 000 إطار. احفظ الفيلم كملف بتنسيق ZI.
تحليل البيانات. قم بتحليل الأفلام المكتسبة باستخدام برنامج تحليلي مناسب للتتبع الجزيئي الأحادي. حدد موقع إحداثيات x و y لكل توطين للبروتين الفلوري من خلال الملاءمة الغوسية لوظيفة انتشار نقطة الشدة.
لتتبع مسار كل توطين ، قم بتعيين عتبة لا تقل عن ثمانية مظاهر مختلفة مستمرة للإطارات لكل توطين وحد أقصى ثلاثة بكسل للتنقل بين كل إطار. احصل على صورة المسار ، ومتوسط الإزاحة المربعة ، بالإضافة إلى معامل الانتشار لجميع التوطين المتتبع. النتائج التمثيلية.
تمرسم متوسط الإزاحة المربعة للمسارات الفردية لبناء التركيب-1A-eMos2 من تقاطعات عصبية عضلية متعددة في ثلاث يرقات مختلفة ، كمتوسط زائد ناقص الخطأ المعياري للمتوسط. كما تم رسم المساحة الواقعة تحت منحنى الإزاحة المربعة المتوسطة. تم الحصول على معامل انتشار Syntaxin-1A-mEos2 بالمثل من تقاطعات عصبية عضلية متعددة وتم رسمه كرسم بياني لتوزيع التردد النسبي.
كشفت عتبة معامل الانتشار عن مجموعتين من Syntaxin-1A ، مجموعة متنقلة وغير متحركة. تم حساب نسبة السكان المتنقلين إلى غير المتنقلين ل Syntaxin-1A-mEos2. استنتاج. يجب أن يوفر هذا الفيديو فهما لكيفية إجراء تتبع البروتين الفردي عند التقاطع العصبي العضلي ليرقات ذبابة الفاكهة.
توفر هذه التقنية طريقة للباحثين في مجال الاتصالات العصبية لتصور ومراقبة حركة وتنظيم البروتينات المفردة بدقة عالية في الجسم الحي.
نظرة عامة
توضح هذه الدراسة تتبع الجزيء الواحد في الجسم الحي باستخدام التصوير المجهري بالموقع المنشط بالضوء (PALM) في نهاية العصب الحركي اليرقة الثالثة من ذبابة الفاكهة. تتيح هذه التقنية التصوير والتتبع عالي الدقة للبروتينات المشبكية الفردية، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم التواصل العصبي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- التصوير الحي
- الفسيولوجيا المشبكية
الخلفية
- تعقيد حركة البروتينات المشبكية بالغ الأهمية لوظيفة الخلايا العصبية.
- يمكن أن يكشف فهم ديناميكيات البروتينات عند التقاطعات العصبية العضلية عن جوانب حاسمة من النقل المشبكي.
- الطرق السابقة كانت تفتقر إلى الدقة اللازمة لتتبع الجزيئات الفردية.
- قد توفر تقنيات الجزيء الواحد رؤى حول التنظيم الديناميكي للمشبك.
هدف الدراسة
- لتوضيح كيفية تتبع تصوير الجزيئات الفردية في الجسم الحي.
- للتحقيق في حركة وتوضع البروتينات المشبكية باستخدام PALM.
- لتوفير منهجية مفصلة للتطبيقات المستقبلية في الدراسات العصبية.
الطرق المستخدمة
- تم استخدام التصوير المجهري بالموقع المنشط بالضوء (PALM).
- استخدمت يرقات ذبابة الفاكهة كنموذج بيولوجي، مع التركيز على النهايات الحركية السابقة للمشبك.
- استخدمت الدراسة ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيًا والتي تعبر عن البروتين المشبكي Syntaxin-1A الموسوم بفلوروفور قابل للتحويل الضوئي.
- سمح تشريح تثبيت اليرقة على قاعدة Sylgard بالتصوير الفعال.
- استخدمت تكوينات ليزر متعددة للتصوير والتحويل الضوئي، وتم الحصول على فيلم من 15,000 إطار للتحليل.
النتائج الرئيسية
- نجحت الدراسة في تتبع بروتينات Syntaxin-1A-eMos2 الفردية عند التقاطعات العصبية العضلية.
- أشارت التحليلات إلى وجود مجموعات متحركة وغير متحركة من Syntaxin-1A بناءً على معاملات الانتشار.
- تم وصف انحراف المربعات الوسطي والتوزيع الترددي لتقييم حركة البروتين.
- تعزز النتائج فهم ديناميكيات البروتينات المشبكية وتنظيمها في الأنظمة الحية.
الاستنتاجات
- توضح هذه الدراسة طريقة قوية لتصور حركة البروتينات الفردية في الخلايا العصبية الحية.
- تسهم النتائج في فهمنا للآليات المشبكية واللدونة العصبية.
- قد تسهل هذه التقنية الدراسات المتقدمة في علم الأحياء المشبكي والاضطرابات العصبية.
