الجمع بين علم البلورات بالأشعة السينية بزاوية صغيرة تبعثر الأشعة السينية نموذج المناطق غير منظم من Nsa1 من سيريفيسيا س.

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج بروتين مؤتلف يتكون من مزيج من المجالات المرتبة والمضطربة للتحليل الهيكلي الهجين عن طريق كل من علم البلورات بالأشعة السينية وتشتت الأشعة السينية بزاوية صغيرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء الهيكلي حول وضع الوظيفة البيولوجية بحيث يظل تحديد جميع الحلول بنية البروتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لنمذجة المناطق الديناميكية للبروتين أو الجزيء الكلي التي لا يمكن حلها عن طريق علم البلورات بالأشعة السينية.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة في البداية لتعلم كيفية تقييم جودة بيانات SAXS الخاصة بهم بشكل صحيح. لبدء الإجراء ، قم بتحويل بلازميد تعبير Nsa1 إلى سلالة تعبير الإشريكية القولونية المناسبة. استزراع الخلايا ، وتحفيز تعبير Nsa1 ، وحصاد الخلايا.

أعد تعليق الخلايا في 25 مل من محلول التحلل ، قبل التبريد إلى أربع درجات مئوية ، تحتوي على قرص واحد مثبط للبروتياز خال من EDTA. قم بتشغيل الخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة سبع دقائق ، مع دورة مدتها ثانيتان ، وثانيتين. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمحللة عند 26 ، 900 ضعف الجاذبية لمدة 45 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

تأكد من أن الخليط لا يتجمد أثناء الطرد المركزي. بعد ذلك ، قم بموازنة عمود تدفق الجاذبية الذي يحتوي على 10 مل من راتنج تقارب الكوبالت الثابت مع عازلة التحلل. قم بتحميل المحللة المصفاة على العمود واتركها تتدفق عبر الراتنج عند أربع درجات مئوية.

ثم اغسل الراتنج مرتين بأجزاء 100 مل من محلول التحلل. قم بإزالة Nsa1 من العمود مع 20 مل من المخزن المؤقت للشطف. قم بتشغيل 15 مللي لتر من eluere على هلام SDS-PAGE من أربعة إلى 15٪ لتأكيد شطف البروتين.

ثم أضف 1 مل من محلول مخزون البروتياز TEV 1 مجم / مل إلى eluere. احتضان eluere عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها لإزالة علامة MBP. بعد ذلك ، استخدم وحدة مرشح الطرد المركزي 10 كيلودالتون لتركيز Nsa1 المشقوق MBP إلى حوالي 5 مل ، مع الحرص على عدم الإفراط في التركيز.

قم بتنقية البروتين المركز على عمود ترشيح هلام متوازن مسبقا باستخدام Buffer A.تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا الإجراء في ضمان إزالة جميع الركام أثناء التنقية. سوف تتداخل المجاميع مع التبلور والحصول على بيانات SAXS وتحليلها. قم بتحليل عينات 15 مللي لتر من كل جزء عمودي باستخدام SDS-PAGE لتأكيد فصل MBP عن Nsa1.

اجمع بين Nsa1 التي تحتوي على كسور. استخدم وحدة مرشح الطرد المركزي 10 كيلودالتون لتركيز الكسور المجمعة إلى حوالي 8 مجم / مل. قم بقياس الامتصاص عند 289 نانومتر واحسب تركيز البروتين.

انتقل على الفور إلى تجارب الفحص والتبلور المحلل للبروتين. لبدء فحص الحالة للبروتين ، قم بإعداد محاليل مخزون 1 مجم / مل من ألفا كوموتريب سين ، والتربسين ، والإيلاستاز ، والكاباين ، والسبتيليسين ، والبروتيناز الداخلي GluC. قم بتخفيف كل محلول مخزون بمخزن مؤقت للتخفيف إلى 1:10 و 1:100 و 1: 1 ، 000.

قم بتخفيف محلول 8 مجم / مل من Nsa1 إلى 1 مجم / مل باستخدام Buffer A. ثم ، لكل تخفيف للبروتياز ، امزج 1 مللي لتر من تخفيف البروتياز مع 9 مللي لتر من مخزون البروتين المخفف. احتضان المحاليل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، أضف 10 مللي لتر من عينة 2x SDS-PAGE للتخزين المؤقت لكل محلول وتسخين المحاليل عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

قم بتشغيل الحلول على هلام SDS-PAGE من أربعة إلى 15٪ لتحديد المجالات المقاومة للبروتياز. قم بإنشاء بنيات تعبير مقطوعة تستبعد مناطق البروتياز المتساوية. التعبير عن هذه البروتينات وتنقيتها لتحسين التبلور.

بعد الحصول على بيانات SAXS لبروتين Nsa1 عبر نطاق من التركيزات ، قم بتعيين مسار ملف shell الطرفي إلى الدليل الذي يحتوي على البيانات. ثم قم بتشغيل برنامج التحليل. قم بتحميل منحنيات التشتت في برنامج التحليل.

استخدم أداة Auto RG لتحديد نصف قطر الدوران وشدة التشتت الأمامي لكل منحنى. بعد ذلك ، قم بإنشاء مخططات Kratky لكل منحنى تشتت لتحديد درجة الاكتناز. استخدم أداة الاستقلال الذاتي لحساب دالة التوزيع الزوجي لكل منحنى ، باستخدام بعد أقصى يبدأ يبلغ 3 أضعاف نصف قطر الدوران.

تحسين الحد الأقصى للبعد للحصول على منحنى دالة توزيع سلس وزوجي يتوافق مع منحنى التشتت التجريبي. قارن المعلمات الهيكلية عبر التركيزات للتحقق من عدم وجود ضرر إشعاعي أو تأثيرات تعتمد على التركيز. من الأهمية بمكان مقارنة المعلمات الهيكلية الرئيسية ، بما في ذلك نصف قطر الدوران والكتلة الجزيئية والتشتت الأمامي ووظائف توزيع المسافة الزوجية عبر سلسلة تركيز.

وذلك لضمان عدم وجود ضرر إشعاعي أو تأثيرات تركيز. بعد ذلك ، قم بتشغيل الأداة المساعدة لطريقة تحسين المجموعة باستخدام ملف بنية بلورات البروتين الأولي ، وملف تسلسل البروتين المستهدف ، وملف بيانات SAXS التجريبي. قارن قيم مربع كاي من ملف البنية البلورية للبدء بملف المجموعة لتحديد ما إذا كان نموذج المجموعة يناسب البيانات التجريبية جيدا.

استخدم برنامج التصور الجزيئي لتراكب التركيب البلوري مع المطابقات التي تم إنشاؤها. لاحظ العدد الإجمالي للمطابقات وجزء الإشغال لكل متوافق يساهم في منحنى التشتت. أدى الانقسام المحلل للبروتين لطرف C المتقابل للبروتياز من Nsa1 إلى تكوين بلورات تقويم العظام.

شكلت Nsa1 المنقاة حديثا بلورات مكعبة ، لكن التركيب البلوري لا يزال يفتقر إلى كثافة الإلكترون للطرف المتقلب c. تم حل مجال مروحة بيتا ذات الشفرات السبعية من Nsa1 بشكل جيد في كلا الهيكلين. لم يكن مجال Nsa1 WD-40 وحده مناسبا لبيانات SAXS التجريبية.

أدى الجمع بين نمذجة الجسم الصلب وإعادة البناء الأولي للطرف C إلى تحسين جودة الملاءمة بشكل كبير. قدمت النمذجة الجماعية تحسنا أكبر في جودة الملاءمة ، مما كشف عن أخذ العينات التأكيدية للذيل الطرفي C في المحلول. في حين أن SAXS هي تقنية هيكلية منخفضة الدقة ، إلا أنها تكمل بشكل جيد الدراسات الهيكلية عالية الدقة ، مثل علم البلورات بالأشعة السينية.

حتى تتمكن من نمذجة المناطق المرنة والمضطربة. من خلال جمع وتحليل بيانات SAXS للجزيء الكبير ، يمكنك البدء في فهم التغيير التأكيدي الذي حدث بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حل بنية البروتين المكون من مناطق مرتبة ومضطربة بواسطة كل من علم البلورات بالأشعة السينية و SAXS.