ميكروبروبي الشعرية التفريد قياس الطيف الكتلي لجميع الخلايا المفردة في أجنة "الضفادع يعيش" (ليفيس النمو)

الهدف العام من هذا البروتوكول هو توصيف المستقلبات في الخلايا الحية للأجنة النامية عن طريق أخذ العينات المجهرية في الموقع قياس الطيف الكهربائي للكتلة الشعرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلية والبيولوجيا التنموية لأنها تتيح تحليل التمثيل الغذائي في الخلايا المفردة مباشرة في الأجنة الحية النامية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة وقابلة للتطوير لأحجام الخلايا المختلفة وتتيح أخذ عينات طفيفة التوغل من الخلايا الفردية في الأجنة الحية.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم بعض الخطوات لأن الجنين يتطور بسرعة نسبيا ويتم استخدام أداة تأين بالرش الكهربائي للرحلان الكهربائي الشعري المصممة خصيصا. ابدأ هذا الإجراء بتحضير 2٪ agarose في محلول 1X Steinberg. بينما لا تزال سائلة ، قم بتغطية قاع أطباق بتري مقاس 60 ملم بالمحلول.

بمجرد أن يبرد جل الاغاروز ويتصلب ، أشعل نهاية ماصة باستور مقاس ستة بوصات حتى تشكل كرة. بعد ذلك ، المس الطرف الساخن برفق لبصمة خمسة إلى 10 آبار بعمق ملليمتر واحد تقريبا في الاغاروز. لتصنيع ماصات دقيقة ذات طرف مدبب ، أولا ، اسحب الشعيرات الدموية البورسليكات في مجتذب الشعيرات الدموية من النوع المشتعل / البني باستخدام الإعدادات الموجودة في بروتوكول النص.

بعد ذلك ، قم بقطع طرف الماصة الدقيقة المسحوبة باستخدام زوج من الملقط الحاد الناعم للحصول على قطر خارجي لطرف شعري يبلغ حوالي 20 ميكرون. قم بتنفيذ هذه الخطوة تحت مجهر استريو للمساعدة في الدقة والاستنساخ. الحصول على الأجنة من خلال التزاوج الطبيعي الناجم عن موجهة الغدد التناسلية ل xenopus laevis البالغ أو عن طريق الإخصاب في المختبر كما هو مشار إليه في بروتوكول النص.

قم بإزالة معاطف الهلام المحيطة بالأجنة عندما تبدأ في الانتصاق في مرحلة الخليتين عن طريق ترك الأجنة ترتاح أولا في محلول إزالة الهلام لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بتدويرها برفق لمدة دقيقتين إضافيتين لمنع الأجنة من الالتصاق بسطح طبق التجميع. صب محتويات الطبق برفق في دورق نظيف وصب محلول إزالة الهلام بسرعة من الدورق

قم بتغطية البيض على الفور بمحلول شتاينبرغ 0.1X لشطف محلول إزالة الهلام المتبقي. قم بتدوير المحلول برفق ثم صب المحلول. كرر هذه الخطوة أربع مرات لغسل الأجنة جيدا.

انقل الأجنة المنزوعة إلى محلول 1X Steinberg في طبق بتري. لتقليل الازدحام داخل الأطباق ، ضع ما يقرب من 100 جنين لكل طبق 100 ملم. قم بفرز الأجنة المشقوقة في مرحلة الخليتين في طبق منفصل حيث يشير التصبغ النمطي بثقة إلى الوصول البطني الظهري مع الإشارة إلى إنشاء خرائط الكبريتات.

حدد الأجنة المشقوقة بشكل صحيح من خلال التأكد من أن ثلم الانقسام الأول ، الذي يشير إلى المستوى المتوسط السهمي ، يقسم سحب المصطبغ الداكن وسحب المصطبغ قليلا بحيث يكون النصفان صورا معكوسة. بعد ذلك ، قم بتركيب ماصة دقيقة مصنعة على معالج دقيق متعدد المحاور. قم بتوصيل الماصة الدقيقة بحاقن دقيق.

استخدم ماصة نقل بلاستيكية لشفط ما يقرب من خمسة من الأجنة المكونة من ثماني خلايا ونقلها إلى طبق أخذ العينات الذي يحتوي على محلول شتاينبرغ 0.5X. باستخدام حلقة الشعر ، ضع الجنين المراد أخذ عينات منه في بئر فردي وتأكد من أن الخلية ذات الأهمية المحددة بشكل صحيح تواجه المسبار الدقيق بزاوية تقريبية تبلغ 90 درجة. أثناء العمل تحت المجهر المجسم، قم بتوجيه طرف الماصة الدقيقة إلى الخلية المفردة المحددة داخل الجنين الحي.

اسحب الجزء المطلوب من محتويات الخلية عن طريق تطبيق نبضات الضغط السلبي على الشعيرات الدموية الدقيقة باستخدام الحاقن الدقيق. اسحب المسبار الدقيق برفق من الخلية وانقل طرفه إلى أربعة ميكرولترات من مذيب استخراج المستقلب المبرد في قارورة صغيرة الحجم. بعد ذلك ، قم بتطبيق زيادة الضغط الإيجابية 80 رطل لكل بوصة مربعة لمدة ثانية واحدة على الشعيرات الدموية باستخدام الحاقن الدقيق لطرد الشفط إلى المذيب.

أغلق القارورة بإحكام لمنع التبخر وضع القارورة مرة أخرى على الثلج حتى تكتمل أخذ العينات. بمجرد اكتمال أخذ العينات ، قم بخلط الدوامة العينة التي تحتوي على قوارير أجهزة الطرد المركزي الدقيقة لمدة دقيقة واحدة تقريبا لتسريع استخراج المستقلبات. ثم, الطرد المركزي القوارير في 8, 000 مرة غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لحبيبات الحطام الخلوي والجسيمات الأخرى.

قم بتخزين مستخلصات الخلايا مع بقايا الخلية وتترسب عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة يوم أو عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى شهر واحد حتى القياس بواسطة CE-ESI-MS. قم ببناء منصة حقن CE القادرة على الترجمة الرأسية السريعة لمرحلة تحمل قارورة المنحل بالكهرباء في الخلفية وتحميل العينة ميكروفيال كما هو مشار إليه في بروتوكول النص. قم بتجميع واجهة CE-ESI عن طريق تركيب باعث معدني الرش الكهربائي أولا في اتحاد T ثلاثي المنافذ.

بعد ذلك ، قم بتغذية الشعيرات الدموية CE للفصل من خلال باعث الرش الكهربائي ، مما يسمح لها بالبروز حوالي 40 إلى 100 ميكرون خارج طرف الباعث. العمل تحت مجهر استريو للمساعدة في الدقة. قم بتوصيل محلول الصفيحة الشعرية بالمنفذ المتبقي لتزويد محلول الرش الكهربائي.

استخدم الأكمام المناسبة والوصلات المشدودة بالأصابع للتشغيل الخالي من التسرب لواجهة CE-ESI. باستخدام حامل الألواح ، قم بتركيب واجهة CE-ESI على مرحلة ترجمة ثلاثية المحاور ووضع طرف باعث الرش الكهربائي على بعد ملليمترين تقريبا من فتحة مطياف الكتلة. لتنظيف مكونات الواجهة ، قم أولا بتزويد محلول صفائح الرش الكهربائي من خلال باعث الرش الكهربائي بمعدل ميكرولتر واحد في الدقيقة و BGE من خلال الشعيرات الدموية لفصل CE.

استخدم مضخات الحقنة لتغذية المذيبات بمعدل ثابت. بعد ذلك ، قم بغسل الشعيرات الدموية لفصل CE قبل كل قياس عن طريق توصيل حقنة بنهاية مدخل الشعيرات الدموية. استخدم محاقن كبيرة بكفاءة لتقليل إعادة تعبئة وتجهيز خطوط إمداد المذيبات.

بعد شطف الشعيرات الدموية للفصل لمدة خمس دقائق تقريبا ، انقل مدخلها إلى محلول BGE الموجود في قارورة الفولاذ المقاوم للصدأ. ضع طرف باعث الرش الكهربائي على بعد ملليمترين تقريبا من فتحة مطياف الكتلة. اضبط هذه المسافة بدقة باستخدام مرحلة الترجمة لتوليد الرش الكهربائي في النظام النفاث المخروطي المستقر أثناء مراقبة الرش باستخدام مجهر استريو.

راقب استقرار التيار الأيوني الكلي أو TIC لمدة 30 إلى 45 دقيقة تقريبا لضمان التشغيل المستقر. قم بتطبيق 21 زائد أو ناقص كيلو فولت على قارورة BGE عن طريق تكثيف الإمكانات تدريجيا على مدار 15 ثانية تقريبا ، وعادة ما تولد ما يقرب من 7.5 ميكرو أمبير من التيار عبر الشعيرات الدموية للفصل باستخدام حمض الفورميك بنسبة 1٪ مثل BGE. قبل كل قياس ، تأكد من استقرار النظام من خلال مراقبة ملف تعريف TIC لمدة خمس إلى 10 دقائق تقريبا ثم قم بخفض إمكانات الفصل تدريجيا إلى صفر فولت.

ماصة ميكرولتر واحد من محلول تبريد الأسيتيل القياسي في قارورة الحقن ونقل الشعيرات الدموية للفصل من قارورة BGE إلى قارورة الحقن. ارفع مرحلة حقن CE 15 سم في ثانية واحدة. بعد 60 ثانية ، قم بحقن ستة نانولترات من العينة في الشعيرات الدموية للفصل.

بعد ذلك ، قم بترجمة المرحلة مرة أخرى إلى مستويات البداية وحرك نهاية المدخل الشعري برفق إلى BGE. بعد ذلك مباشرة ، قم بتكثيف جهد CE لبدء الفصل الكهربائي واكتساب حالة EMA. بمجرد اكتشاف المعيار ، أوقف الحصول على البيانات وخفض جهد الفصل تدريجيا إلى صفر فولت.

ثم استرجع الباعث إلى سنتيمترين من الفتحة. اغسل الشعيرات الدموية للفصل لمدة خمس دقائق قبل تحليل مستخلص الخلية. قم بقياس 10 نانولترات من مستخلص الخلية المفردة بتكرار هذه الخطوات باستخدام 90 ثانية لحقن العينة هيدروديناميكيا.

يظهر هنا مخطط كهربية تمثيلي لمستخلص الخلية ، حيث يتم عرض فصل سلسلة من المستقلبات المحددة. تم تحديد 70 إشارة مختلفة بثقة عالية كمستقلبات قطبية صغيرة بناء على وقت الهجرة وأنماط تجزئة MS / MS لإشارات استخراج الخلية مقارنة بتلك الموجودة في المكتبات الطيفية القياسية أو من المكتبات الطيفية ذات الكتلة الترادفية. يتم تحديد المستقلب من خلال مقارنة الكتلة الدقيقة ووقت الهجرة وسلوك التجزئة للإشارة غير المعروفة من العينة بمعيار المستقلب أو البيانات المتاحة في قاعدة بيانات المستقلب.

يتم عرض هذه الخطوة للهيستيدين. هنا ، يتم عرض الخلايا الظهرية الفردية التي تم تحديدها وأخذ عينات منها باستخدام المسبار الدقيق CE-ESI-MS في المراحل الجنينية المكونة من ثماني خلايا و 16 خلية و 32 خلية. كشف التحليل متعدد التنوع للمستقلبات المحددة في أنواع الخلايا الثلاثة المختلفة عن ملامح أيضية مختلفة واتجاهات أيضية معقدة عبر مراحل الخلية.

كشف تحليل المكون الرئيسي للبيانات الوصفية الكمية عن التغيرات الأيضية كخلية سلفة محددة للجنين المكون من ثماني خلايا مقسمة لتشكيل استنساخ خلية في الجنين المكون من 16 خلية و 32 خلية. يتم عرض الاتجاهات التمثيلية لمستقلبات محددة. انخفضت المستقلبات مثل الأسيتيل كولين بكثرة مع انقسام الخلايا ، بينما أظهر الترولامين والسيرين / الأرجينين اتجاهات متعارضة في هذه الأنواع من الخلايا.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية بسرعة كبيرة ، عادة في أقل من 10 ثوان لكل خلية. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما بدأنا في رسم خرائط لعدم تجانس الخلايا الأيضية في جنين xenopus laevis المبكر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام قياس الطيف الكتلي الكهربي الشعري للمسبار الدقيق لتحليل المستقلبات في الخلايا الجنينية المفردة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل بسرعة لأن التمثيل الغذائي ديناميكي وتنقسم الخلايا بسرعة في الجنين النامي. أيضا ، افحص التفاصيل التحليلية لضمان جمع بيانات عالية الدقة النوعية حول عملية التمثيل الغذائي للخلايا. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى تشخيص العينات الحية لأن نهج قياس الطيف الكتلي للمسبار الدقيق يعمل بسرعة ، وهو طفيف التوغل ومتوافق مع العينات الصغيرة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تتبع الكبريتات من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تأثير المستقلبات على مواصفات الأنسجة. لا تنس أن العمل مع إمدادات الطاقة عالية الجهد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل العزل الكهربائي للواجهات المكهربة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.