قياس النفاذية الحاجز الظهارية في أورجانويدس المعوية البشرية في الوقت الحقيقي

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس نفاذية الحاجز الظهاري في العضيات المعوية البشرية بمرور الوقت. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض الجهاز الهضمي ، مثل كيف يمكن للسموم المحددة أو المنتجات البكتيرية أو حتى العلاجات الدوائية أن تغير نفاذية الحاجز الظهاري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بكل من التصور والقياس الكمي لنفاذية الحاجز الظهاري في الوقت الفعلي واستخدام الأنسجة الظهارية المعوية البشرية.

قبل الحقن الدقيق للعضيات المعوية البشرية ، يجب إعداد الحاقن الدقيق ، وإعداد الشعيرات الدموية الدقيقة وتركيبها واختبارها كما هو موضح في بروتوكول النص. لملء الشعيرات الدموية الدقيقة بمادة الحقن ، اغمر طرف الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاجية في تعليق الحقن FITC-dextaren ، مع الحرص على تجنب كسر طرف الشعيرات الدموية الدقيقة على جانب أو أسفل الأنبوب. اسحب حقنة الزيت المعدني لسحب ما يقرب من 10 ميكرولتر من تعليق FITC-dextran في الشعيرات الدموية الدقيقة.

عندما يملأ تعليق الحقن المجهري 90٪ من طول الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاجية ، توقف عن ملء الشعيرات الدموية الدقيقة. اضغط على المحقنة قليلا قبل سحب الشعيرات الدموية الدقيقة من محلول الحقن المجهري للتأكد من أن طرف الشعيرات الدموية الدقيقة لا يحتوي على جيوب من الهواء. قم بإزالة لوحة الثقافة العضوية المعوية البشرية من حاضنة زراعة الخلايا ونقلها إلى خزانة السلامة الحيوية باستخدام الحاقن الدقيق.

قم بإزالة الغطاء من لوحة الثقافة وتوسيط البئر الأول على مرحلة المجهر بحيث يكون مرئيا بوضوح من خلال عدسة المنظار بأقل إعداد تكبير. قم بتدوير ذراع المعالجة الدقيقة بحيث يتم توجيه الشعيرات الدموية الدقيقة لأسفل في بئر المزرعة بزاوية أكبر من 45 درجة بالنسبة لمرحلة المجهر. ضع طرف الشعيرات الدموية الدقيقة فوق بئر الثقافة الأولى على ارتفاع سنتيمتر واحد تقريبا فوق سطح الوسائط.

تأكد من رؤية كل من طرف الفتيل الزجاجي والعضوية المعوية البشرية من خلال العدسة. مفتاح الحقن المجهري الناجح هو محاذاة الشعيرات الدموية الدقيقة بعناية مع العضوية قبل محاولة الحقن المجهري. وأوصي دائما بأن يتدرب المستخدمون الجدد على الأنسجة الاحتياطية قبل محاولة تجربة حاسمة.

عن طريق تدوير مقبض التحكم في المحور z في اتجاه عقارب الساعة ، قم بدفع الشعيرات الدموية الدقيقة ببطء. اخترق العضوية المعوية البشرية بطرف الشعيرات الدموية الدقيقة. سوف ينخفض السطح الخارجي للعضوية المعوية البشرية قليلا عندما تبدأ الشعيرات الدموية الدقيقة في الضغط ، وستعود إلى شكلها عندما يخترق الطرف التجويف.

إذا كانت هناك صعوبة في رؤية طرف الشعيرات الدموية الدقيقة داخل التجويف ، فاضبط إعدادات الإضاءة أو التكبير لمجهر التشريح. عندما يتم وضع الشعيرات الدموية الدقيقة بشكل صحيح مع طرف الشعيرات الدموية الدقيقة بالقرب من مركز العضلة المعوية البشرية ، قم بإزالة اليدين من أدوات التحكم في المعالجة الدقيقة. اضغط على المحقنة المملوءة بالزيت المعدني قليلا لدفع محلول الحقن المجهري خارج الشعيرات الدموية الدقيقة إلى التجويف العضوي المعوي البشري.

قد تتوسع العضوية المعوية البشرية قليلا لاستيعاب حجم الحقن. مع وضع الشعيرات الدموية الدقيقة فوق الوسائط لتجنب التلف العرضي للعضيات المعوية البشرية أثناء المناورة ، انتقل إلى الهدف العضوي المعوي البشري التالي. بين العلاجات أو في حالة الكسر ، قم بتغيير الشعيرات الدموية.

قم بفك المشبك الموجود في نهاية ذراع المعالج الدقيق وقم بإزالة الشعيرات الدموية الدقيقة من حامل الماصة الدقيقة. لاختبار المركبات التي يتم تسليمها إلى الظهارة القمية ، يجب إعادة تعليق المركب في PBS معقم يحتوي على ملليغرامين لكل مليلتر FITC-dextran. في هذه التجربة التمثيلية ، أعد تعليق توكسين المطثية العسيرة TcdA ، أضف 12.8 نانوغرام لكل ميكرولتر في PBS الذي يحتوي على FITC-dextran قبل الحقن المجهري.

حقن المركب في التجويف العضوي المعوي البشري كما هو موضح في القسم السابق. لاختبار المركبات التي يتم تسليمها إلى الحجرة الجانبية القاعدية ، بعد الحقن المجهري ل FITC-dextran ، استبدل وسائط الثقافة الخارجية بوسائط جديدة تحتوي على اثنين من المليمولار EGTA كعنصر تحكم إيجابي ، أو مركبة PBS وحدها كعنصر تحكم سلبي ، أو مركب تجريبي آخر. ابدأ التصوير المباشر مباشرة بعد الحقن المجهري.

تظهر هذه الصورة التمثيلية للمجال الساطع عضوية معوية بشرية مشتقة من الأنسجة بعد الحقن المجهري ل FITC-dextran. تظهر إشارة الفلورسنت حتى بدون استخدام مجموعة مرشحات محددة. تم حقن العضيات المعوية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية بأربعة كيلودالتون FITC مترافق ديكستران معلق في PBS ، أو PBS الذي يحتوي على توكسين المطثية العسيرة TcdA.

كعنصر تحكم إيجابي ، تمت إضافة EGTA إلى وسائط الثقافة العضوية المعوية البشرية في مجموعة فرعية من العضيات المعوية البشرية المحقونة ب PBS و FITC-dextran. تم تصوير العضيات المعوية البشرية لمدة 20 ساعة. كما يتضح من هذه الصور ، احتفظت العضيات المعوية البشرية المحقونة ب PBS تقريبا بجميع إشارة الفلورسنت الموجودة عند T صفر.

ومع ذلك ، أظهرت العضيات المعوية البشرية التي تم حقنها أيضا ب TcdA ، أو عولجت ب EGTA ، انخفاضا كبيرا في شدة الفلورسنت بمقدار ثماني ساعات بعد الحقن المجهري. تم تحديد بيانات التصوير لجميع العضيات المعوية البشرية في جميع النقاط الزمنية لإنشاء مجموعة بيانات عالية الدقة تمثل التغيير النسبي في شدة الفلورسنت بمرور الوقت في كل حالة تجريبية. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في حوالي 30 دقيقة إلى ساعة واحدة اعتمادا على عدد الظروف التجريبية.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التحلي بالصبر وتأخذ وقتك عند محاذاة العضيات المعوية البشرية مع الشعيرات الدموية الدقيقة قبل الحقن المجهري. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، واللطخة الغربية ، والبحث عن الحمض النووي الريبي للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق باستجابة العضوية المعوية البشرية للمادة المحقونة. سمح لنا تطوير هذه التقنية بفحص تأثيرات السموم البكتيرية والعوامل الدوائية والسيتوكينات وحتى الكائنات الحية الدقيقة الحية على وظيفة الحاجز الظهاري في العضيات المعوية البشرية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحقن الدقيق للديكستران المسمى بالفلورسنت والمواد التجريبية الأخرى في تجويف العضوية المعوية البشرية. لا تنس أنه عند العمل مع السموم البكتيرية أو الكائنات الحية ، يمكن أن يكون ذلك خطيرا للغاية ، ولذا يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء. وأخيرا ، كن حذرا بشكل خاص لتجنب الجروح الثقبية لأن الشعيرات الدموية الدقيقة حادة للغاية.