تحليل الاستنساخ من سلائف الخلايا الجذعية الجنينية المكونة للدم باستخدام مؤشر وحيد الخلية الفرز جنبا إلى جنب مع الخلية البطانية مكانة ثقافة المشارك

الهدف العام من هذه الطريقة هو تحديد خصائص النمط الظاهري وإمكانات النقش للخلايا الجذعية المكونة للدم النسيلي أو سلائف HSC أثناء التطور الجنيني للفئران. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تكون الدم التنموي حول مساهمات النسب الفريدة لسلائف HSC النسيلة أثناء التطور الجنيني. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن السلائف الدموية يتم تحليلها على مستوى الخلية الواحدة.

هذا يسمح بتحديد خصائص النمط الظاهري الفريدة التي تميز سلائف HSC النادرة. ابدأ بإضافة الشريان الأورطي الغدد التناسلية المتوسطة ، AGM ، الأنسجة التي تم تشريحها من الأجنة بين 9.5 و 11.5 يوما بعد الجماع إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على 10 مل من PBS مكمل بنسبة 10٪ FBS على الجليد. عندما تستقر الأنسجة في قاع الأنبوب ، استنشق المادة الطافية وأضف على الفور ملليلتر واحد من 0.25٪ كولاجيناز إلى العينات.

بعد 25 دقيقة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، أوقف التفاعل باستخدام مليلتر واحد من PBS بالإضافة إلى FBS واستخدم طرف ماصة سعة مليلتر واحد لترثيل الأنسجة من 20 إلى 30 مرة حتى يتم الحصول على معلق خلية واحدة. ثم قم بتخفيف الخلايا بثمانية ملليلتر إضافي من PBS بالإضافة إلى FBS وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لمدة خمس دقائق على الجليد.

ثم أضف 500 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة المعنية. بعد حضانة لمدة 15 إلى 20 دقيقة على الجليد ، اغسل الخلايا في ثمانية ملليلتر من PBS بالإضافة إلى FBS وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من PBS الطازج بالإضافة إلى FBS. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلوية 35 ميكرومتر في أنبوب سعة خمسة ملليلتر ، واغسل المصفاة بثلاثة ملليلتر إضافية من PBS بالإضافة إلى FBS لجمع كل الخلايا وطرد الخلايا مرة أخرى.

ثم أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS بالإضافة إلى FBS وضع الخلايا على الجليد. لضبط بوابات الفرز في وضع فرز الخلية الفردية والفهرس ، قم بتحميل كمية صغيرة من الخلايا على مقياس التدفق الخلوي واضبط الاستحواذ على أقل معدل تدفق. افتح منطقة مبعثر أمامية مقابل مخطط منطقة التشتت الجانبية وقم بتعيين بوابة لتضمين خلايا مختلفة الحجم.

افتح منطقة مبعثر أمامية مقابل مخطط عرض التشتت الأمامي ومنطقة مبعثر جانبية مقابل مخطط عرض مبعثر جانبي وقم بتعيين بوابة في كل مخطط لاستبعاد المضاعفات. قم بتعيين منطقة مبعثر أمامية مقابل مخطط DAPI لبوابة الخلايا الحية. ثم قم بإنشاء كاديرين البطاني المضاد للأوعية الدموية مقابل مستقبلات البروتين البطاني المضاد للبروتين C وبوابة مستقبلات البروتين البطاني الوعائي الإيجابية والعالية التي تعبر عن الخلايا التي تعبر عن البروتين البطاني C.

لفرز خلايا الشريان الأورطي والغدد التناسلية المتوسطة ، ضع صفيحة مكونة من 96 بئرا مستزرعة مسبقا مع الخلايا البطانية AGM في وسط خال من مصل AGM بالإضافة إلى السيتوكينات في كتلة لوحة مقياس التدفق الخلوي وقم بتحميل العينة التجريبية. ابدأ في الحصول على العينة وتأكد من تحديد وضع الخلية المفردة لفرز الفهرس لفرز خلية واحدة في كل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا. عندما يتم فرز خلية واحدة في كل بئر من اللوحة ، ضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة على 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة تصل إلى سبعة أيام.

في نهاية فترة الزراعة المشتركة ، يمكن تصور مستعمرات المكونة للدم بأحجام وأشكال مختلفة باستخدام مجهر مقلوب بتكبير 100X. لتحليل المستنسخة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، استخدم ماصة متعددة القنوات لفصل الخلايا المكونة للدم عن الطبقات البطانية دون فصل الخلايا البطانية. ثم انقل 100 ميكرولتر من الخلايا إلى آبار فردية للوحة جديدة ذات 96 بئرا على شكل حرف V وأعد الصفيحة الأصلية المكونة من 96 بئرا التي تحتوي على 100 ميكرولتر المتبقية من الخلايا إلى حاضنة زراعة الأنسجة.

قم بتكسير الخلايا الموجودة في اللوحة السفلية على شكل حرف V عن طريق الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية عن طريق قلب اللوحة ونقرها بحركة واحدة سريعة. أعد تعليق الكريات في كل بئر ب 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب عند أربع درجات مئوية. بعد خمس دقائق ، أضف كوكتيل الأجسام المضادة محل الاهتمام إلى كل بئر لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

في نهاية الحضانة ، اغسل كل بئر ب 200 ميكرولتر من PBS بالإضافة إلى FBS ، مع النقر على اللوحة في نهاية الطرد المركزي للتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الكريات في 50 ميكرولتر من PBS بالإضافة إلى FBS وتحليل الخلايا وفقا لبروتوكولات تحليل التدفق القياسية للكشف عن المستعمرات التي تحتوي على إمكانات الخلايا الجذعية المكونة للدم. عند اختيار الآبار التي تحتوي على خلايا ذات نمط ظاهري للخلايا الجذعية المكونة للدم عن طريق تحليل التدفق ، استخدم ماصة متعددة القنوات لإعادة تعليق 100 ميكرولتر المتبقية من الخلايا من الزراعة المشتركة الأصلية وإضافة خمسة في 10 في 10 إلى خلايا نخاع عظم الإنقاذ الرابعة في 100 ميكرولتر من PBS بالإضافة إلى 2٪ FBS لكل بئر.

بعد النقل بالتبني لكل استنساخ إلى فردية متلقية للإشعاع المميت ، اجمع عينات الدم المحيطية من المطعمة على فترات منتظمة بعد الزرع. لتحديد المستنسخة ذات النقش طويل الأمد ، قم بتحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي وفقا لبروتوكولات تحليل التدفق القياسية. يمكن بعد ذلك ربط خصائص النمط الظاهري لكل استنساخ بخصائص النقش الخاصة به.

يمكن إثراء الخلايا الجذعية المكونة للدم من خلال إيجابية الكاديرين البطانية الوعائية ومستوى عال من تعبير مستقبلات البروتين البطاني C. يسمح التلوين بالأجسام المضادة المترافقة الأخرى بالفلوروكروم بالتحليل بأثر رجعي لمعلمات النمط الظاهري الإضافية التي يمكن تسجيلها لكل خلية أثناء فرز الفهرس. بعد فرز المؤشر في الثقافات المشتركة للخلايا البطانية الشريان الأورطي والغدد التناسلية المتوسطة ، تندمج المستنسخة الفردية في طبقة الخلايا البطانية الشريان الأورطي والغدد التناسلية المتوسطة قبل أن تبدأ المستنسخة في التجمع وتشكيل مجموعات مكونة للدم.

بعد خمسة إلى سبعة أيام من الزراعة المشتركة ، يمكن اكتشاف مستعمرات بأحجام وأشكال مختلفة. هنا ، يتم عرض أربع مستعمرات مختلفة تم الحصول عليها بعد الزراعة المشتركة مع ثلاث مستعمرات توضح نسبا مختلفة من الخلايا الجذعية المكونة للدم المظهرية جنبا إلى جنب مع أنواع الخلايا الأخرى الأكثر تمايزا والمستعمرة الرابعة التي تفتقر إلى الخلايا ذات التعبير عن علامات الخلايا الجذعية المكونة للدم. يسمح النقل بالتبني لذرية الخلية المستنسخة بتقييم قدرة النقش متعدد السلالات على المدى الطويل لكل استنساخ بعد مساهمة المتبرع في حجرات الخلايا النخاعية B و T للدم المحيطي للمتلقي بمرور الوقت.

على الرغم من أن معظم المستعمرات التي تحتوي على خلايا ذات نمط ظاهري للخلايا الجذعية المكونة للدم حققت تطعيم طويل الأمد ، إلا أن الزرع ضروري لتأكيد النقش الوظيفي متعدد السلالات حيث تفقد بعض المستنسخة النقش بمرور الوقت. يمكن بعد ذلك ربط إمكانات الخلايا الجذعية المكونة للدم الوظيفية لكل استنساخ بمعلمات فرز الفهرس الأصلية لهذا الاستنساخ لتحديد خصائصه المظهرية الدقيقة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الثقافة الثانوية لذرية المكونة للدم على السدى الذي يدعم تطور الخلايا البائية والتائية في المختبر للإجابة على أسئلة إضافية حول إمكانات الخلايا الليمفاوية لسلائف الدم الفردية.